补体结合试验

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1、补体结合试验补体结合试验补体是一组正常血清蛋白成分，可被免疫复合物激活产生具有裂解细胞壁的因子。如果 该过程发生在红细胞表面上则导致红细胞裂解而出现溶血。利用这种反应来检测血清中的抗 体或（抗原），称作补体结合试验（Complement Fixation Test, CFT）。CFT准确性高，容易 判定，对抗原纯化要求不严格，因而普遍用于传染病的诊断。该试验的不足之处是操作繁锁， 尤其是对所用试剂的准备和量化要求较严。（一）原理CFT包括两个系统，第一为反应系统,又称溶菌系统，即已知抗原（或抗体）， 被检血清 （或抗原）和补体。第二系统为指示系统（亦称溶血系统），即溶血素绵羊红细胞， 溶血素即

2、抗绵羊红细胞抗体。补体常用豚鼠血清，它对红细胞具有较强的裂解能力。补体只 能与抗原抗体复合物结合并被激活产生溶血作用。因此，如果试验系中的抗原和抗体是对 应的，形成了免疫复合物，定量的补体就被结合，这时加入指示系统，由于缺乏游离补体， 就不产生溶血，即为阳性反应。反之试验系中缺乏抗原或特异性抗体，不能形成免疫复合物， 补体就游离于反应液中，被指示系统，即溶血素绵羊红细胞免疫复合物激活，而发生溶血， 即阴性反应。为了测定阳性血清中抗体的效价，可将血清作系列稀释，其结果是由完全不溶 血逐步达到完全溶血，发生50%溶血的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价。在进行CFT主试验之前，抗原、补体、绵羊红细

3、胞和溶血素必须经仔细测定。所加补体 的量必须准确，补体少导致不完全溶血，出现假阳性结果；反之，超量的补体不能被反应系 统的免疫复合物完全结合从而出现假阴性结果。超量的抗原影响补体的结合，抗原不足不能 完全结合补体。在CFT操作中，经常遇到的一个问题是被检血清存在“抗补体作用”即被检血清在无 抗原存在的情况下结合补体。这有多种可能的原因，主要原因是血清取自感染动物，在血清 中存在免疫复合物；或者血清被细菌污染，通过其它途径激活了补体。（二）分类 补体结合试验分直接法、间接法和固相法。1. 直接法 如图2-9所示，该法为最常用的操作方法，在试管中加抗原、被检血清和补 体，在一定温度下感作一定时间后

4、，加溶血素和红细胞，再感作一定时间后判定结果。直接 法又根据试剂量的差异分为常量法和微量法。常量法试剂总量一般为0.5ml。微量法一般为 0.125ml。前者在试管内进行，后者在U形底的96孔微量反应板内进行。图 2-9 直接补体结合试验图示2. 间接法 如图 2-10 所示，该法用于禽类血清抗体的测定（如鸭、火鸡、鸡等）。因其 血清抗体与相应的抗原形成复合物后不能结合豚鼠补体，需再加一种抗该抗原的兔抗体，后 者形成复合物后可结合豚鼠补体，然后再加补体和溶血系统成分。与直接法相比间接法多加 一种特异性免疫抗体，多进行一次感作。其结果判定正好与直接法相反。发生溶血时表示抗 原已和血清中的抗体结合

5、，阻止了兔抗体与抗原的结合， 补体仍然游离存在， 然后与溶血 系结合，发生溶血，即为间接CFT阳性；反之，若血清中无相应的抗体存在，抗原则与兔抗 体结合形成免疫复合物结合补体，不发生溶血，即为间接CFT阴性。图 2-10 间直接补体结合试验图示3. 固相法 固相法的原理与直接法相同,其不同点是所有的反应是在琼脂糖凝胶反应皿 中进行。其操作程序为先将溶血素致敏的红细胞液加入融化后冷至55C的1%琼脂糖凝胶 中，混匀，倾注入特制的塑料反应皿内。（反应皿规格为90（25mm，凝胶量为25ml）。待其凝 固后打孔，孔径为6mm，孔距不得小于8mm。然后将在37C温箱中感作一定时间的抗原+被 检血清+补

6、体混合物取25ul加入孔中，37C感作一定时间，观察溶血环的直径以确定结果 的阴阳性。（三）操作方法 以牛边虫病直接 CFT 的常量法加以详细介绍。对补体效价的测定，以 前国内均采用100%溶血测定法，而目前国际流行 50%溶血测定法。当溶血现象近于零或趋 近完全时补体量的明显变化只能引起轻度的溶血现象，而在趋近50溶血时极小量的补体 变化可引起程度显著不同的溶血现象。因此50溶血测定法显然要比100测定法敏感度 高,对补体的测定更精确。本节只介绍50补体溶血测定法。1. 制备绵羊红细胞悬浮液(1) 采血 绵羊(最好母绵羊)颈静脉无菌采血。将40ml的血与60ml阿氏液混匀，冷藏 备用。供血羊

7、一次采血量最多不要超过200ml,采血间隔不少于6周。(2) 洗红细胞 将10ml阿氏液保存的绵羊血通过纱布过滤倒入40ml刻度离心管内，另 加30ml巴比妥缓冲液(VBS)，混匀。在水平转子离心机上离心10分钟(500Xg)。吸弃上清液， 加VBS至原来的量，再次离心，如此离心洗涤三次。吸弃上清液。每管约加10ml VBS,混 匀。将悬液倒入15ml容量的刻度离心管中，离心10分钟(500Xg)。储存于48C冰箱备 用。红细胞可保存56天。(3) 制备5绵羊红细胞悬浮液 选择一管洗过的红细胞。如果红细胞与液面间出现溶血应再离心洗涤，直至清亮。 若多次洗涤仍有溶血，则表示红细胞太脆或缓冲液有问

8、题，应弃去不用。 记录红细胞的毫升数，吸弃上清液，用VBS稀释红细胞，使成为5%的红细胞悬液 (1ml 红细胞 +19ml VBS)。 为了精确配制悬液可用分光光度计检测红细胞的浓度(波长550nm)取1ml约5%的细胞悬液，加19ml的蒸馏水混匀。用分光光度计检测其透光度，在表 上查出红细胞的浓度(见附录3)。如果红细胞的浓度不等于5%,可加VBS或离心去除VBS校正浓度。计算如下：需加(或去除)VBS的量=实测红细胞浓度(细胞悬液总量/5 细胞悬液总量。注意：一般在最初配制悬液时稍浓于所需浓度，校正时只加一定量的VBS即可。(4) 致敏红细胞 将5%的红细胞悬液与等量适当稀释的溶血素混和，

9、置室温15分钟. 混和时总是将溶血素加到细胞液中。2. 配制标准比色管(1) 准备血红素液 取10ml 5%的红细胞悬液，加到15ml的刻度离心管中，离心5分 钟(500Xg)。吸弃上清液，加蒸馏水至9.5ml,混匀，这时红细胞完全溶解，液体应是清亮 的。加进0.5ml 17%的氯化钠液，混匀，使其保持等渗。(2) 配制比色管 按表2-12配制标准比色管，试管规格为12x75mm.因所用抗原、血清、 补体和溶血素均为无色液体，所以用VBS代替。血红素为5%红细胞溶血液。表2-12标准比色管的配制溶血度(%)0102030405060708090血红素(ml)0.00.010.020.030.0

10、40.050.060.07.0.80.05%红细胞(ml)0.10.090.080.070.060.050.040.030.020.0VBS(ml)0.40.40.40.40.40.40.40.40.40.4离心混均3. 补体效价的测定(1) 试验当天打开一瓶补体，解冻。若是冻干的补体需加定量蒸馏水复原(2) 取0.2ml补体加9.8mlVBS(低温)作1/50稀释。按表2测定补体效价。补体原液置 34保存。表2-13补体效价的测定举例试管号1234561/50 补体(ml)0.010.020.030.040.050.06VBS(ml)0.290.280.270.260.250.24致敏红细胞

11、(ml)0.20.20.20.20.20.2将试管置37C水浴锅内，感作30分钟，每5分振钟荡一次。与标准管比较，记录血度此量。(3) 以溶血度为横坐标，补体的用量为纵作标绘制曲线。找出50溶血的补体所用量， 为一个单位补体。(4) 补体效价计算基础计算：用于CFT的补体用量为3个单位补体。X=滴定前补体稀释倍数/(30(1个单位补体量)X：配制3个单位补体所需补体原液的稀释倍数。校正计算：在试验中发现补体在感作中损失一部分活性，根据经验需使用基础计算 补体用量的1.5倍，即直接配4.5个单位的补体。但习惯上仍称为3个单位。其计算公式为:X=滴定前补体稀释倍数/(45(1个单位补体量)4. 溶

12、血素的效价测定(1) 稀释溶血素按表3稀释溶血素。表2-14溶血素的稀释稀释度溶血素量(ml)生理盐水量(ml)1100溶血素原液*0.219.815001/100溶血素1.04.017001/100溶血素1.06.018001/100溶血素1.07.019001/100溶血素1.0&011 000溶血素原液*2.018.011 2001/100溶血素0.55.511 4001/100溶血素0.56.511 6001/100溶血素0.57.511 8001/100溶血素0.5&512 0001/100溶血素0.59.512 2001/1 000溶血素2.02.412 5001/1 000溶血素

13、2.03.012 8001/1 000溶血素2.03.613 0001/1 000溶血素1.02.014 0001/1 000溶血素1.03.015 0001/1 000溶血素1.04.0* 如果溶血素用等量甘油保存，所需量加倍。(2) 配制100ml 5%的绵羊红细胞悬液并致敏。取17个试管，每管加1.5ml 5%的红细 胞悬液，然后分别加不同稀释倍数的溶血素1.5ml,混匀。室温静置15分钟。(3) 配制1/50稀释的补体。(4) 用不同稀释倍数的溶血素致敏的红细胞分别做补体效价测定。结果参考表2-15。表2-15溶血素测定结果举例补体用量(1/50稀释)溶皿素稀释度0.100.090.0

14、80.070.060.050.040.030.020.011:100一一一一一9580602001:500一一一一一9885702501:700一一一一一9895702001:800一一一一一990702001:900一一一一一9890703001:1 000一一一一一9880703001:1 200一一一一一9590702501:1 400一一一一一9590702501:1 600一一一一一9880702501:1 800一一一一一9890702001:2 000一一一一一9575701001:2 200一一一一一9880452001:2 500一一一一989880451501:2 800一一一9898907050