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1、第一部分：基本理论抗原抗体反应抗原抗原的两种特性：免疫原性、免疫反应性 共同抗原、交叉反应、异嗜性抗原、超抗原等抗原的分类依据性能：完全抗原、不完全抗原依据抗体产生是否要T cell刺激：胸腺依赖性抗原（TD-Ag ）、 胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）丝裂原刀豆蛋白A（ ConA）T细胞有丝分裂原植物凝集素T细胞有丝分裂原美洲商陆丝裂原T细胞和B细胞有丝分裂原脂多糖（LPS）B细胞有丝分裂原葡萄球菌A蛋白（SPA）B细胞有丝分裂原抗体结构与功能：略IgG单体分子、血清和细胞外液中含量最高IgM五聚体、分子量最大、不能透过胎盘、宫内感染指 标IgA有两种类型（血清型和分泌型）对新生儿早期抗感 染
2、十分重要IgD单体分子、膜结合型IgD是Bcell分化成熟的标志IgE单体分子、含量最少、特异性过敏和寄生虫感染中 有意义抗原抗体反应原理纟口合力、亲和力与亲合力抗原抗体反应特点特异性；比例问题：等价带、刖带、后带；可逆性影响因素反应物抗原理化性质、抗原表位等抗体来源：R型血清和H型血清特异性与亲和力反应条件电解质、酸碱度、温度、比例抗原抗体的制 备免疫原的制备颗粒性免疫原的制备较简单、分离或纯培养可溶性抗原的制备粗抗原制备：捣碎组织、破碎细胞、粗提取 分离与纯化、浓缩与保存人工免疫原的制备将半抗原与载体结合，常用蛋白质作为载体合成肽抗原的制备合成肽属于半抗原的一种，所以基因工程抗原的制备获得
3、目的抗原的基因编码，然后扩增纯化抗体的制备多克隆抗体制 备使用免疫原免疫动物获得抗体、又叫抗血清； 弗氏完全佐剂（CFA，石蜡油+羊毛脂+卡介苗）和 弗氏不完全佐剂（IFA，石蜡油+羊毛脂）大致过程：获取、鉴定、纯化、保存单克隆抗体 （McAb）制备原理：杂交瘤技术等亲本细胞的选择与融合：无菌取脾HAT培养基的选择作用阳性克隆选择与克隆化制备单克隆抗体：在小鼠腹腔诱生出肿瘤并产生含McAb的腹水鉴定、保存、应用基因工程抗体的制备抗原抗体的纯 化离心分离差速离心粗分离；会有共沉；分离分子量相差大的物质；动 力学方法密度梯度离心用于分离密度相近大小不同；常用介质为庶糖、甘 油；离心刀离的物质密度
4、定要人密度梯度丿I质 的最大密度；有共沉等密度梯度分离大小相同密度不同的物质；介质常用铯盐；铯 盐对铝有腐蚀，防止溅出；不会有共沉沉淀分离盐析法原理：盐的存在减弱了蛋白分子周围的水化膜，导 致蛋白发生聚集而沉降有机溶剂沉淀优：分辨率高、溶剂易除；缺：有毒、可能会是蛋 白失活非离子聚合物 沉淀常用聚乙二醇离子交换层析凝胶层析常用凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、Superdex亲和层析利用欲分离物质和它们的特异性配体间具有特异性亲和力电泳有支持体纸电泳醋酸纤维薄膜溥层电泳（溥膜或溥板）非凝胶性支持体区带电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶 等）凝胶支持体区带电泳（淀粉液、聚丙烯酰胺凝胶）无支持
5、体Tiselius移界电泳显微电泳等点聚焦电泳等速电泳密度梯度电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳区别第二部分：免疫检验技术1.沉淀反应可溶性 抗原；多 克隆抗体 更适合；R型血清首 选液相沉淀试验环状沉淀试验：定性絮状沉淀试验抗体稀释法、棋盘格法（找出Ag、Ab最佳比例）凝胶沉淀试验单向扩散试验定量试验；两个曲线双向免疫扩散 试验定性）沉淀线数目：抗原或抗体不纯；沉淀线弯向分子量 大的；沉淀线靠近浓度低的；可以测定效价（半定量）免疫电泳对流免疫CIEP双扩+电泳；Ag向正极泳动、Ab向负极泳动火箭电泳单扩+电泳；定量免疫电泳先蛋白区带电泳、再双扩免疫浊度测定（定量）透射浊度测定
6、、散射浊度测定免疫速率抑制 浊度测定用一定量的已知半抗原-载体与限量特异性抗体反 应，测定生成的半抗原-载体-抗体所造成的散色速率2.凝集反应 颗粒性 抗原或带 有可溶性 抗原的载 体 定性试 验直接凝集试验玻片凝集定性；多用于红细胞ABO血型试管凝集半定量、多用于Ab ；外斐试验、肥达试验间接凝集试验将抗原与某一 载体结合；常 用载体：人O型RBC、 SRBC、SPA等间接凝集试验正向间接凝集试验用抗原致敏颗粒检测抗体反向间接凝集试验用已知抗体检测抗原间接凝集抑制 试验用已知抗原致敏颗粒和相应抗体，检测样本中是否 有与致敏颗粒相同的抗原，有正向和反向间接血凝试验载体颗粒为红细胞其它凝集试验抗
7、球蛋白试验 (Coombs 试 验)是抗球蛋白参与的间接血凝试验直接Coombs检测已粘附在RBC的不完全抗体；新生儿溶血、自身免疫溶血性贫血间接Coombs血清中游离抗体；多用于检测母体Rh(D)协同凝集试验载体颗粒为SPA的间接凝集试验冷凝集试验检测冷凝集素的方法，04弋最明显自身红细胞凝集试验主要试剂为抗人O型红细胞MCAb，可以与各型 RBC结合却不引起凝集；样本为全血特点是排除由于红细胞凝集可能引起的假阳性3.补体试验系统：缓冲液PBS补体SRBC溶血素补体测疋试验血清总补体活 性(CH50)测定活化经典途径；为么要50%溶血作为终点测定；意 义旁路活化途径 (AP-H50)测定EG
8、TA螯合Ca2+，封闭Cl，阻断经典途径补体结合试验分为直接(不溶血为阳性)和间接(溶血为阳性)两类实验结果要对照众多对照实验观察4.酶免疫技 术(E)疋量或疋 性固相载体最常用聚苯乙烯酶和底物最常用辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP);还有P-半乳糖胺酶分类双抗体(原)夹 心检测抗原最常用；只适用于二价或二价以上大分子 抗原双位点一步法双抗夹心时，待测样品和酶标物一起加入间接法检测抗体最常用竞争法既可测抗原，又可测抗体；参考管和待测管对照观 察5.荧光免疫 技术(F)*阳性细胞 数量和荧 光强度可 以作为定S p. six 1-1 量或半疋 量指标吊用荧光物质异硫氰酸荧光 素(FIT
9、C)最常用、最广泛；黄色或橙黄色粉末；激发后发出 黄绿色四乙基罗丹明(RB200)橘红色粉末；激发后为橘红色荧光四甲基异硫氰 酸罗丹明 仃 RITC)紫红色粉末，激发后有橙红色荧光；猝灭速度慢藻蛋白类藻红蛋白PE(此类最吊用)、藻冃蛋白PC、力别藻冃蛋 白APC ；多呈现橙色或红色物质荧光显微技术光源短波光；波长连续或不连续；滤板隔热滤板、激发滤板、吸收滤板；光路透射光或落射光分类直接染色法荧光标记抗原（抗体）直接检测抗体（抗原）间接染色法酶联免疫+荧光标记补体结合免疫 荧光Ag,Ab结合激活补体；荧光素标记抗补体的抗体；双标记染色标记不同抗体检测同一样品流式荧光免疫技 术定量分析或纯化；流式
10、细胞仪与荧光免疫结合6.放射免疫 技术（R）*精确测定 各种微量 物质放射免疫分析（RIA）原理：标记抗原（可以为半抗原）Ab*和非标记抗原Ab对特异性抗体 Ag（定量）的竞争结口反应计数仪丫射（1311,1251）线用晶体闪烁计数仪B射线（57C%OCO）用液体闪烁计数仪免疫放射分析（IMRA）原理以过量标记的抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结 合反应，时间段，灵敏度较RIA高，操作较简单分类单位点IRMA直接用放射标记物质检测另一个双位点IRMA同时与待测抗原的两个抗原位点结 合；灵敏度高间接IRMA双抗夹心结合间接法再结合IRMARIA与IRMA的比较P1697.金免疫技 术快速诊断胶体金
11、特性胶体特性电解质可以使之水化膜破坏而聚集沉淀呈色性和光吸 收颗粒直径520nm :葡萄酒红色；颗粒直径 2040nm :深红色；颗粒直径60nm :蓝紫色等分类斑点金免疫渗 滤试验（DIGFA）（可以定性）将特异性抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜上，其下 面有吸水材料，形成渗滤装置；阳性有红色出现有间接法和双抗夹心法斑点金免疫层析试验双抗夹心法较大分子抗原；质控线红色且T区 显红为阳性竞争法小分子抗原或半抗原；质控线红色 且T区显红为阴性&化学发光 免疫分析 技术高灵敏高 特异性发光原理分子或原子中的电子吸收能量跃迁后回到基态会发出光子，从而发光化学发光常温下，伴随化学反应过程所产生的光的发射现
12、象发光标记物直接参与发光 反应的标记物标记物本身就是化学发光中的能量转移载体，发光 底物；如鲁米诺类、吖啶酯类、苯酚类以催化反应或 能量传递参与 发光的酶标记 物即作催化剂，又参与化学发光反应HRP对鲁米诺和H2O2 起催化作用ALP应能非酶递记与氧化反不直接参与化学发光反应；二联吡啶钌 应的非酶标记物具体技术化学发光免疫以化学发光物质（如吖啶酯）直接标记Ag或Ab,发分析(CLIA)生免疫反应后，直接引发化学发光进行检测化学发光酶免 疫技术(CLEIA)采用催化某一发光反应的酶标记Ag或Ab,形成酶 标记抗原-抗体化合物；加入了催化发光的酶，使发 光速度加快生物发光免疫 分析(BLIA)利用
13、生物发光物质标记Ag或Ab微粒子化学发 光免疫分析顺磁性微粒子为载体、用ALP标记；以AMPPD作 为发光剂电化学发光免疫分析二联吡啶钌是电化学发光免疫分析用的发光剂；检 测广泛；持续时间长；信号强；灵敏度高等第三部分：具体物质的检测免疫细胞的检 测细胞分离法夕卜周血WBC的 分离自然沉降法和高分子聚合物沉降法外周血单个核 细胞分离密度梯度离心法；淋巴细胞分离玻璃器皿吸附；媳妇过滤；磁铁吸引淋巴细胞亚群 的分离纯化E玫瑰花结分离：T细胞能结合SRBC结合尼龙分离：T细胞表面绒毛短少，B则多长、易吸附 在在尼龙毛上亲和板结合法：单抗与不同亚群的淋巴细胞结合在 板上不易被洗掉流式细胞仪分选法磁性激
14、活细胞分离器分离法：用于T细胞亚群分离T细胞检测表面标志检测用间接免疫荧光、酶免疫技术等检测T细胞表面的 表面标志，如CD分子和MHC等T细胞受体检 测E受体检测人T细胞有SRBC抗体，可形成玫 瑰花环IL-2受体检测双抗体夹心、ELISA等T细胞功能检 测T细胞增殖试 验3H-TdR掺入法MTT比色法T细胞介导的 细胞毒性试验形态学检杳5iCr释放法CTL介导的细胞凋亡检测法抑制性T细胞 功能检测利用ConA诱导Ts细胞上匕较诱导 与未经诱导的T对B抗体产生的抑 制，评价T市功能B细胞检测表面抗原检测检测 CD19、CD20、CD22 等B细胞受体检 测SmIg标志的检测花环形成试验检测B细胞表面的Fc受体B细胞功能检 测体内检测免疫球蛋白测定血清中血型抗体的测定体外检测反向溶血空斑形成实验等自然杀伤细胞的检测、吞噬细胞检测细胞因子
