《第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第一链 cDNA 合成试剂盒 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书2013-12-07 13:20:16Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒包装与含量 小瓶/瓶盖 标签 适用于 a) 04 379012001b)04896866001c1红色TranscriptorReverseTranscriptase (逆转录酶)a) 1 瓶，25 pl (20 U/pl)b) 1 瓶，50 pl (20 U/pl)c) 2瓶，各50 pl (20 U/ pl)储存缓冲液：200 m
2、M 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Trit on X-100(v/v), 50% 甘油(v/v), pH 约为 7.22无色Transcriptor RTReaction Buffer(5x)(逆转录缓冲液)a) 1 瓶， 1 mlb) 1 瓶， 1 mlc) 2 瓶，各 1 ml 5x浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCI, 40 mM MgCI2, pH 约为 8.5(25C)3 无色ProtectorRNase Inhibitor( RNase 抑制剂)a) 1 瓶， 50 pl(40 U/pl)b) 1 瓶， 100 pl(40 U/pl)c) 2瓶，各1
3、00 pl(40 U/pl)储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCI，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约 为 7.6 (4C)4黄色/ 紫色Deoxynuc-Ieo-tideMix( dNTP)a) 1瓶，100 pl(黄色瓶盖)b) 1瓶，200 pl(紫色瓶盖)c) 2瓶，各200 pl(紫色瓶盖) dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各 10 mM5蓝色Anchored-oligo(dT)18Primer(锚定 oligo(dT)18 引物)a) 1 瓶，100 pl(50 pM)b) 1 瓶，200 pl(50 pM)c) 2瓶，各
4、200 pl(50 pM)6Random Hexamera) 1 瓶， 100 pl(600 pM)蓝色Primer (随机引物)b) 1 瓶， 200 pl(600 pM)c) 2瓶，各200 pl(600 pM)7绿色Control RNA(对照 RNA )a) 1 瓶， 20 pl(50 ng/pl)包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA片段稳定溶液8绿色Control Primer Mix PBGD(对照基因引物)a) 1 瓶， 40 pl 5 pM人类PBGD特异性正向与反向引物9(b和c为瓶7)无色Water, PCR-gradea) 1 瓶， 1 mlb) 2 瓶，各 1 m
5、lc) 3 瓶，各 1 ml注意：货号为和的产品不含有 control 试剂(瓶 7 和瓶 8)，因此瓶 7 即为 Water, PCR-grade。储存条件及其稳定性请将该产品存放于-15-25C条件中，并于产品标签上的有效期之前使用。注意：Control RNA(货号的瓶7)应储存于-70OC条件。请避免将产品反复冻融！2 产品使用方法2.1 实验前准备样本材料RNA模板：分离的总RNA，mRNA,病毒RNA或体外转录的RNA。注意：想要得到较好的RT结果，使用高质量完整的RNA(不含基因组DNA残留、RNA酶、抑 制剂)是必要的。请根据以下预防措施进行操作，避免使RNA在分离过程中受到R
6、NA酶的污染 (从细胞裂解开始)：-使用RNA酶抑制剂(如Protector RNase Inhibitor)或在使RNA酶失活的分离条件下进行操作。-如果有必要，用凝胶电泳分析过程中不同步骤(裂解、分离)以确保样本中不含有RNA酶。-请记住RNA酶也可能出现在受到污染的玻璃容器中。为了准备总RNA或mRNA,我们建议您使用罗氏应用科学部的试剂。为了筛选出能够产生高质 量的适用于RT-PCR的完整RNA模板，请参考第3部分。补充信息：想了解订货信息或查看相 关核酸分离纯化指南，请访问 www.roche-applied- 想了解关于使用 MagNA Pure LC System 或 MagNA
7、 Pure Compact System 进行核酸自动分离的更多信息，请 访问 .引物 六聚物随机引物在常规的RT反应中，使用5pg的总RNA模板，可采用60pM的随机引物终浓度。使用5pg总 RNA并增加随机引物浓度，将增加短片段PCR产物(的产率，但是相应地，长片段PCR产 物及全长转录子的产率会降低。在非特异引物的反转录方法中，随机引物法是最多使用的一种方 法，其特异性的扩增产物只能通过后续的PCR反应中使用特异的PCR引物获得。锚定oligo(dT)18引物锚定oligo(dT)18引物特异性地结合在带有poly(A)+的RNA片段上，这类片段通常只占总RNA 的1-2%,因此用锚定o
8、ligo(dT)18引物进行反转录所获得的cDNA产率大大低于随机引物方法。 如果实验是为了获得新mRNA的RT-PCR产物，则推荐使用锚定oligo(dT)18引物。使用该方 法获得的 RT-PCR 产物具有较强的一致性。 特异性序列引物使用特异性序列引物，其终浓度推荐为2pM。但是请注意，即使这些引物在以DNA作为模板的 PCR反应中成功获得扩增产物，相同的引物序列却可能难以定位在cDNA片段上。如果遇到此 类情况，请使用锚定oligo(dT)18引物重新进行第一链合成反应。2.2 实验流程标准 RT-PCR 流程在此提供两种不同的操作流程： A：反转录使用锚定oligo(dT)18引物或
9、六聚物随机引物或特异性序列引物。在大多数情况下， 只选择其中的一种引物进行cDNA合成。 B：反转录使用oligo(dT)18引物和六聚物随机引物的混合物。这种方法可提高反应敏感度，但 与使用单一 oligo(dT)18 引物比起来反应特异性会降低。注意：根据您使用的引物类型，参考以下给出的流程A与Bo流程A：使用锚定oligo(dT)18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物合成cDNA。以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。图1为单一反应和多重反应中 cDNA合成流程概述。单一反应多重反应RNA+引物+水可选：变性10min 65C冰上配置多重RT反应混合液(除RNA模
10、板)并分装到各反应管添加模板RNA到每个反应管中置于冰上，添加缓冲液， RNase Inhibitor， dNTPs， Transcriptor RT锚定oligo(dT)18引物/特异性序列引物30min 55C 或 1h 50C六聚物随机引物10min 25C30min 55C 或 1h 50C85C 失活 5min添加1-5 pl至PCR体系或RT-PCR体系准备cDNA 合成图1：单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述 使用前先将所有冷冻试剂解冻。 开始实验前将所有试剂轻度离心。 实验开始后保持将所有试剂置于冰上。将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20 pl反应体系为例，
11、按照以下组分准备模板-引物混合物。注意：进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。模板-引物混合物(1 次反应) 成分 体积 最终浓度总RNA或poly(A)+ mRNA1 pg总RNA或10 ng poly(A)+ mRNA引物 - 以下任选其一：Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50 pmol/pl (瓶 5)1 pl2.5 pM 或 Random Hexamer Primer, 600 pmol/pl (瓶 6)2 pl60 pM或 Sequence-Specific Primer可变0.5-2.5 pMWater, PCR-grade (瓶7或9)可变使总体积为
12、13 pl总体积13 pl以上为初实验的建议浓度。为了得到合适的模板浓度，需要使总RNA的量在10 ng到5 pg之间，使mRNA的量在1 ng到100ng之间。注意：当RNA样本浓度较低( 10 pg/ml)时，添加10 pg/ml MS2 RNA*以使RNA模板稳定。可选步骤：在65OC条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。此步骤可确保RNA二级结构变性。 立即将反应管置于冰上冷却。在含有模板-引物混合物的反应管中加入下表中其余的RT反应液组分。成分体积最终浓度Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5x（瓶 2）
13、4 pl1x（8 mM MgCl2）Protector RNase Inhibitor,40 U/pl（瓶 3）0.5 pl20 UDeoxynucleotide Mix,每种dNTP各10 mM（瓶4）2 pl每种 dNTP 各 1 mMTranscriptor Reverse Transcriptase,20 U/pl（瓶 1）0.5 pl10 U最终体积20 pl 在反应管中将试剂小心混匀。注意：不要旋涡！ 将反应管轻度离心使样本收集于反应管底部。 反应时使用带热盖的加热模块，防止反应管中的液体挥发。根据您所使用的引物以及目标mRNA的长度，RT反应孵育时间参考下表：使用的引物目标 mR
14、NA的长度RT反应孵育时间Anchored-oligo（dT）18 Primer, 50 pmol/pl 或 Sequence-Specific Primer不超过 4 kb55C 下 30min超过 4 kb50C 下 60minRandom Hexamer Primer, 600 pmol/pl不超过 4 kb25C 下 10min，之后 55C 下 30min超过 4 kb25C 下 10min，之后50oC下60min 加热至 85oC 维持 5min 使 Transcriptor Reverse Transcriptase 失活。 将反应管置于冰上以终止反应。反应管在+2+8P下可保
15、存1-2小时，在-15-25七下可保存更长时间。此cDNA产物无需经过纯化即可用于PCR反应。 一般来说，使用1-5 pl第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。若是最初的实验，可尝试在 50 pl PCR体系中使用2 pl cDNA作为模板。如果在LightCycler System上进行PCR，在20 pl的反应体系中使用2-5 pl cDNA或cDNA 稀释液。注意：逆转录反应工作液中MgCl2的最终浓度为8 mM，因此PCR反应混合液中每pl的cDNA 反应液模板带入了 8 nmol MgCl2,根据实际需要优化反应液中的MgCl2浓度。Transcriptor Reverse Transcriptase
