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1、人源抗肿瘤坏死因子_ 噬菌体抗体的基因结构分析a人源抗月中瘤坏死因子0噬菌体抗体的基因结构分析袁 斌 何 君 俞晓峰 王 慧 刘怀田 周育森 黄 策() 军事医学科学院微生物流行病研究所北京 100071a摘要 从混合的噬菌体抗体库中筛选到了抗人TNF的人源单克隆抗体，并对筛选到的抗体基因a进行了序列测定和分析。结果表明,筛选到的4个特异性抗TNF噬菌体抗体克隆的重链基因序列 相同 , 该重链基因长681 bp , 编码 227 个氨基酸残基属于人免疫球蛋白第 ? 家族 , 其中 1,119 位氨() ( ) 基酸残基为重链可变区VH,120,227 位为重链恒定区 1 CH1 。 4 个噬菌
2、体抗体克隆的轻链均缺失 , 因此实际上筛选到的是单重链抗体 。对重链基因编码的重链蛋白的特性进行了分析。关键词 肿瘤坏死因子; 噬菌体显示; 单克隆抗体; 重链 ; 测序a The gene sequencing and analysis of anti 0TNFhuman monoclonal antibodiesYuan Bin , He J un , Yu Xiaofeng , Wang Hui , Liu Huaitian , ZhouYushen , Huang Ce( )Institute of Microbiology and Epidemiology , Academy of
3、MilitaryMedical Sciences , Beijing 100071a Abstract Human anti OTNFmonoclonal antibodies were selected from pooled human antibody combinatorial libraries using phage display technology , and their genes were sequenced and analyzed. The results showeda that the genes encoding heavy chains of the four
4、anti OTNFantibodies were the same , which comprised 681 nu2 cleotidesand encoded a protein of 217 amino acids , belonging to human IgG ? genefamily , wherein 10119() amino acids constituted the V region of the heavy chain VHand1200 227 amino acids constituted the C1 re2( ) gion of the heavy chain CH
5、1. All of the four antibodies lacked the light chain , showing that they were all the same mono heavy chain antibody. The characteristics of heavy chain protein encoded by the heavy chain gene were also analyzed.Key words tumor necrosis factor ; phage display ; monoclonalantibody ; heavy chain ; seq
6、uencing1 抗体库技术自 1989 年问世以来, 发展很快 ,HIV 、 HAV 、 HBV 噬菌体抗体库由王海涛教授赠送。它与传统的杂交瘤技术相比，具有制作周期短、操作 菌株XL10Blue、质粒 p TNF 、 pComb3、 pBluescript 简便 、成本低等优点 , 特别是该技术可以不经免疫而 及辅助噬菌体VCSM13均为本实验室保存。直接制备人源抗体，这对于制备针对于人自身抗原1 . 2 主要试剂a( a)组分如月中瘤坏死因子 OTNF来说 , 具有其他抗体各种限制性内切酶均购自 Promega 公司 , 兔抗 制备方法不可比拟的优势。我们利用这种技术从混a合的噬菌体抗体
7、库中直接筛选到了抗 TNF的人源a M13 IgGOHRP由毛春 生博士赠送。重组人TNF按2 抗体 , 并对抗体的重链和轻链基因进行了克隆和测 文献从 p TNF 菌株中提 取和纯化。 序 。 1 . 3 混合噬菌体抗体库的制备分别取HIV、HAV、HBV噬菌体抗体库保存液各以101 ,分别按文献3的方法制备噬菌体抗体。用( PBS 缓 冲 液 50 mmol/ L 磷 酸 缓 冲 液 , p H 7 . 2、 1 % 1 材料和方法) BSA 、 150 mmol/ L NaCl 将 3 种噬菌体抗体库适量稀12释为10cpu ,并等量混合,冻存于070 ?。1 .1噬菌体抗体库、菌株及质
8、粒)al .4 噬菌体抗体的筛选及鉴定，说明它们是人重组TNF的特异性抗体。文发表民以纯化的人重组TNF为固相抗原按文献3的2.2 重链轻链基因的序列测定a方法用混合的噬菌体抗体库进行 5轮筛选，筛选到 选取4个特异性抗TNF噬菌体抗体克隆，分别 的阳性克隆按文献4的方法进行鉴定。克隆其重链和轻链基因 , 并进行两端测序 , 结果发现 ,4 个克隆的重链基因序列完全一致, 将两端序列 1 . 5 噬菌体抗体克隆质粒 DNA 的提取与纯化用经过鉴定的噬菌体感染 XL10Blue后铺板，过测定的结果合并后得到图1的基因序列 。 4 个克隆 夜培养后挑取单菌 落 接 种 于 含 50 mg/ L 羧
9、 苄 青霉 的轻链基因序列不一致, 序列分析表明这4 个基因( ) 素 、 10 mg/ L 四 环 素 的 LB 培 养 基 中 培 养 过 夜 , 用 均不能编码完整的多肽链测序结果略, 因此 , 这 4 Promega A7100 试剂盒提取和纯化质粒 。 个噬菌体抗体克隆的轻链实际上是缺失。2 . 3 重链基因结构分析 1 . 6 重链 、轻链基因的克隆将提 取 和 纯 化 的 质 粒 分 别 用 Spe I/ Xho I 和 对图 1 的重链基因序列进行分析表明 , 重链基 S al I/ Xba I 双酶切 , 用低熔点胶法回收约 660bp 大 因长 度 为 681 bp , 编
10、 码 227 个 氨 基 酸 残 基 , 经 与 小的 DNA 片 段 , 并 与 用 相 同 酶 切 的 pBluescript KS GeneBank的已知序列对照分析,它与已知的几种人+ （?连接,转化XL10 Blue后,在含XOgal、IPTG的LB IgG ? 家族的重链基因恒定区同源性高达98 % 检索） 平板上挑取白色转化子, 并用 PCR 和酶切方法鉴定结果略 , 因此我们获得的抗体重链基因片段属于IgG 第 ? 家族 。对照已知的抗体序列 , 我们发现该插入了重链和轻链基因片段的转化子。1 . 7 重链和轻链基因序列的测定重链基因的第 1,119 位的氨基酸残基为抗体重链将
11、带有重链轻链插入基因的转化子接种于含的可变区 ,120,227 位氨基酸残基为抗体重链的恒50 mg/ L 羧苄青霉素 、 10 mg/ L 四环素的 LB 培养基 定区 。我们在检索中没有发现与该抗体重链可变区 中培养过夜, 用 Promega A7100 试剂盒提取和纯化质部分有高同源性的已知基因 , 因此该重链基因片段粒 。在 Beckman 373A 型 DNA 自动测序仪上从两端 为新发现的抗体重链基 因。2 . 4 抗体重链基因编码的重链蛋白的特性分析进行DNA 序列测定 。我们在计算机上用 ProtParam Tool 预测了重链基因编码的蛋白质的特性, 结果表明 , 重链基因编
12、码2 结果的蛋白含 227 个氨基酸残基, 其中带负电荷的氨基酸残基有12个，带正电荷的氨基酸残基有20个，各2.1阳性克隆的筛选及鉴定氨基酸的含量和占总蛋白的百分比如表 1所示。其 从最后一次淘筛洗脱下 来的噬菌体克隆中随机相对分子质量为2395.8 ,理论等电点为9.28。该蛋 选取64个克隆,制备噬菌体抗体进行鉴定，有61个a白在哺乳动物细胞、酵母和大肠杆菌中的理论半衰 克隆能与TNF结合，通过其他多种方法确定其中7a （期分别为5.5h 、3min和2min 。个克隆对TNF具有高亲和性和特异 性结合能力另不*EirB cAST f.j-JH !1i!ln w1 .勺4=itUI.w.
13、 t L11.T. flrX- 4Xi亡 5TV：T父 trF* &.1青*用H-l对.4wui5 J ：4KJ 1rAE 1 ra口 例一hF 叫工，kKd-7W 14 R4rr iJ*k !3* B4J h-修 fi一1Tn b - .,1j=PAn.4 七r1;- JT f *riFi ip 否EJ*h./*!V；1 1Uill0.rIf IFBli -I1 *ri!sl*：.x z而 TiT rTK. IfUAh： 3.ri L我h ,ir?f gx- Jljn：J? tWA；.*qmtf-.8r：1felt.IS -；事： 口1J!17 1中L*M*i-SiJ.闻宜9A T*- 粉ivT Ci*F.r 邛TItE工ri Aruu.-jT：卜 -：鼻iTH*1*LF w.J /liinI1i1! 1骂.LLjn2t* ity; mr 1f77E VW i T4ir! T*w七 b认二次 AIF KT心E小,rtF2 . *1*e 1A小V(工La iV钳 界:MiIIV_ jlJ *=助胃一 %-igN帛 炉7TE V1Vl.鼻Jsr&FL;? JiQ ;Q*T ,那n*F
