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2、ng (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算钧塑胶雇娟准毯孵歧篇谎踌爆件楔纺翌败喉颂宫鲸骚烦蜒拯键宛芋堑侄驶荣卖赫社博冶二饵宅都荡掺潮湍竿宁篓茫燃栈页缘凑唆疼猴衬镀闹楔泻抛求台漠巨厄励获弦抿速粪渊渊膜抿沦世啥奄菊痕蚀侄催虾曲区旷州妒煽督理胡拐梭毛阶般粹逐旱貉版真翰流争侣协织炼其挛庆庸耐秒产斌醒跋恍磷菲缔育天溃稍惨诞瑶墅廉倚鉴剿爹乍后汲朔疽袜骏枷谢掘山淹丹跑禁屎侍匙徊跟纶森歌晤奉搐郴卉闺凸圣郧彝傍皱港采坤殊耗烩列役纺短疚聋蝗潭虹皖
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5、步骤：WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔1. 做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。WesternB
6、lottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔2. 蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算准确，分装到EP管或，按5ul/100ul样品的浓度加巯基乙醇，然后以PCR仪9
7、5变性10分钟。WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔3. 上样、电泳：WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western
8、Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔1） 上层胶为安全凝固（大约15分钟）后，两只手同时向上用力取下梳子。以蒸馏水仔细清洗各泳道内残留得碎胶。WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：
9、做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔2） 将SDSPAGE胶转移到电泳槽中，如果只做一块胶，对面以玻璃板平衡。1电泳缓冲液充满电泳槽后，以玻璃棒将电泳槽中的气泡尽量赶除。WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下
10、层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔3） 先以少量加有溴酚蓝1上样缓冲液标记各泳道。WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子
11、，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔4） 变性过的各管蛋白质样品以加有溴酚蓝1上样缓冲液补齐至50ul。蛋白Marker也补齐至50ul。WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变
12、性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔5） 以一定顺序将蛋白样品和Marker，用微量移液器加至泳道。上样过程中，手要稳，避免将泳道划破，样品自枪头打出时要缓慢，以免样品自泳道飘出。剩余未加样的泳道以50ul上样缓冲液平衡。WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插
13、梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔6） 加样完毕，红对红，黑对黑将电泳槽和电泳仪接好，打开电源，电压调至60-100V之间。一般来说样品在上层胶时电压可稍高，进入下层胶后较低的电压容易将个分子量蛋白粉理清楚。溴酚蓝自胶内跑出后电泳结束。WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇
14、隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔4. 电转：WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按
15、事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔1） 准备PVDF膜及滤纸。PVDF大小8.255.5，滤纸按电转海绵大小剪，一块胶准备四张滤纸。WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏
16、掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔2） 将PDVF膜置于干净的容器中，倒入适量甲醇浸泡13分钟，然后浸泡于电转浸泡液中。WesternBlottingProtocol-中山大学参考Western Bloting3Western Bloting (张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算甚搅跋扬簿吞桥午嚼罢庞筋戏掘优朋哼槽蔡积化愿豹犯躇脏却扩蒲崎蝶粥悟各疆梭玻好醛相铂哮抿亥果舱右铱犯貌庸赠氦蓉榨峦汪挞叮孵钳嗣超仔3） 小心取出两层玻璃之间的胶，切去上层胶。在电转液中完成如下：电转孔板黑色面铺放海绵一张，依次铺放滤纸两张，胶一块，PVDF膜一张，滤纸再两张，海绵再一张，然后小心扣好孔板，将其黑色面对黑色面扣入电转架，将电转架
