蛋白质含量测定方法

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1、蛋白质含量测定院系名称食品与生物工程学院学生姓名学号 200606021064专业班级指导教师二OO九年四月一日蛋白质含量测定方法比较 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前 常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin 酚试 剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定 法，即考马斯亮蓝法（ Bradford 法）。其中 Bradford 法和 Lowry 法灵敏度最高， 比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂， 但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方

2、法的标准蛋白质。值得注意的是， 这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液 用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的， 都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法 （Bradford 法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3C0NHC0NH3）是两 个分子脲经180C左右加热，放出一个分子氨后 得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuS04形成紫色络合物，称为双缩脲反应。 凡

3、具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这 类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分 无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质 主要硫酸铵、 Tris 缓冲液和某些氨基酸等。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪 蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校 正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计 算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶

4、液。牛血清清蛋白用H2O或 0.9%NaCl配制，酪蛋白用0. 05N NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸 铜（CuS045H20）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4064H20），用500毫升水溶解， 在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁 涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后

5、加入4毫升双缩脲试剂。充 分摇匀后，在室温（2025C ）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加 蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量 为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓 度。注意样品浓度不要超过 10mg/ml。二、Folin酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法， 由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所 取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即

6、 Folin 酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深 兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物,Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深 兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin一酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化 学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺 点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一 性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Low

7、ry反应。 而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖 类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%）， 三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响， 但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠氢氧 化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠 氢氧化钠溶液的浓度12倍。（二）试剂与器材1试剂（1）试剂甲：（A）10克Na2C03, 2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4064H20）。溶解于500毫升蒸馏水中。（B） 0

8、.5克硫酸铜（CuS045H20） 溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂 甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2W042H20） ,25 克钼酸钠（Na2Mo042H20）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓 盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2S04）, 50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过 量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至 1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定

9、，酚酞作指示剂， 然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液： 精确称取结晶牛血清清蛋白或g球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。 牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9 % NaCl 溶液。2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16 支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管， 1支作空白， 3支留作未知样品，其余试 管分成两组，分别加入0， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0毫升标准蛋白质溶液（浓 度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡 混合

10、器上迅速混合，于室温（2025C ）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙 （Folin酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。 然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制 出标准曲线。注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确 控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时， 1分钟后，第2支试管 加入 5 毫升试剂甲， 2 分钟后加第 3 支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若 已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.

11、5毫升试剂乙， 1分钟后第2支试管加 入0.5毫升试剂乙， 2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂 后，再放置 30 分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时， 为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个 试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两 排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。Folin酚试剂法实验表格：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0（250mg/ml ）未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约

12、250mg/ml ）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700）2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20250微克） ，按上述方法 进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲 线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加 3 个试管。 如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光

13、度值，在标准曲线上查出相应的蛋 白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的 酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只 适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。三、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限 制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立 的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种 蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一

14、 方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的 位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认 为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相 结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出 优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质一染料复合物有高 的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（ 2 ）测定快

15、速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟 左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1 小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和 蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各 种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质 测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用g球蛋白为标准蛋白质，以减 少这方面的偏差。（二）试剂与

16、器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用g球蛋白或牛血清清蛋白（BSA）,配制成 l.Omg/ml和O.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G250染料试剂：称 100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用 水稀释至 1 升。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管 16 支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管， 1 支作空白， 3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中 顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加 入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到 0.1ml。 最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮