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1、九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997)3 试验目的本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。4 定义染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单
2、体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。5 试验基本原则在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用
3、中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。6 试验方法6.1 试剂和受试物制备6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquin
4、oline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘benzo(a)pyrene、环磷酰胺(cyclophosphamide)。6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。6.1.3 受试物6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实贮存不影响其稳定性。6.1.3.2 溶剂的选择：
5、溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首选溶剂是培养液（不含血清）或水。二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，使用时浓度不应大于0.5%。6.1.3.3 受试物浓度设置（1） 最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度(osmolality)的改变。（2） 细胞毒性的确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在的两种条件下确定细胞毒性，例如细胞覆盖程度（degree of confluency）、存活细胞计数(viable cell counts)或有丝分裂指数(mitotic index
6、)。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。（3） 剂量设置：至少应设置3个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范 围应包括从最大毒性至几乎无毒性；通常浓度间隔系数不大于 2 。 在收获细胞时，最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计 数或有丝分裂指数（均应大于50%）。 对于那些相对无细胞毒性的化合物，最高浓度应是5l/mL， 5mg/mL或0.01mol/L。 对于相对不溶解的物质，当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性， 则最高剂量应是，当处理期结束时，在最终培养液中溶解度限 值以上的一个浓度。在某些情况下（即仅当高于最低不溶解浓 度时才发生细胞毒性），应使用一个以上可看见沉淀的浓度。最 好在试验处
7、理开始和结束时均评价溶解度，因为由于细胞、S9 等的存在，在试验系统内在暴露过程中溶解度可能变化。不溶 解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。6.1.4 培养液：采用MEM(Eagle)，并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、链霉素，按100IU/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可选用其它合适的培养液。6.1.5 活化系统通常使用的是S9混合物（S9 mix）。S9是从经酶诱导剂（Aroclor 1254或苯巴比妥钠和-萘黄酮联合使用）处理的啮齿动物肝脏获得的。S9的制备同Ames试验。S9的使用浓度为1%10%（终浓度）。S9 mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定，但需对S9mix
8、的活性进行鉴定，必须能明显活化阳性对照物。也可使用下述S90.125mlMgC12 （0.4 mol/L）0.02 mlKC1（1.65mol/L）0.02 ml 葡萄糖-6-磷酸1.791mg 辅酶（氧化型，NADP）3.0615mg 用无血清MEM培养液补足至1mL.6.2 试验步骤6.2.1 细胞：使用中国地鼠卵巢（CHO）细胞株或中国地鼠肺（CHL）细胞株。6.2.2 试验时，应同时设阳性对照物，阴性对照物和至少3个可供分析的受试物浓度组。6.2.3 试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中，放CO2培养箱内培养。6.2.4 试验需在加入和不加入S9 mix的条件下进行。试验时
9、，吸去培养皿（瓶）中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9 mix（不加S9 mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理2h6h。结束后，吸去含受试物的培养液，用Hanks液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱，于24h内收获细胞。于收获前2h4h，加入细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1g/mL）。 当受试物为原料时, 如果在上述加入和不加入S9 mix的条件下均获得阴性结果，则尚需补加另外的试验，即在不加S9 mix的条件下，使受试物与试验系统的接触时间延长至24h。 当难以得出明确结论时，应更换试验条件，如改变代谢活化条件、
10、受试物与试验系统接触时间等重复试验。6.2.5 收获细胞时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000r/min1200r/min的速度离心5min7min，弃去上清液，加入0.075mol/L KC1溶液低渗处理，继而以新配制的甲醇和冰醋酸液（容积比为3:1）进行固定。按常规制片，用姬姆萨染液染色。6.2.6 作染色体分析时，对每一处理组选200个（阳性对照可选100个）分散良好的中期分裂相（染色体数为2n2）进行染色体畸变分析。在分析时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位
11、置及畸变类型。6.3 统计处理：对染色体畸变细胞率用X2检验，以评价受试物的致突变性。6.4 结果评价：在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中具有致突变性：（1） 受试物引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并有与剂量相关的增加。（2） 受试物在任何一个剂量条件下，引起具有统计学意义，并有可重复性的阳性反应。 在评价时应把生物学和统计学意义结合考虑。7 试验报告试验报告应包括以下内容：（1） 受试物名称、有关的理化性状、所用溶剂及其配制、剂量选择（应说明受试物对细胞毒性的测定方法、溶解情况等）;（2） 细胞株名称;（3） 实验条件和方法 代谢活化系统：制备S9时所用酶的诱导剂、选用的动
12、物品种和来源、S9mix的配方； 对照物：阳性对照物名称和选用浓度；阴性（溶剂）对照物名称及使用浓度。 培养液：所用培养液名称、血清类别和使用浓度； 接种时的细胞密度以及所用培养皿（瓶）的规格； 中期分裂阻断剂：名称、所用浓度、作用时间； 处理时间：受试物与试验系统的接触时间； 简述制片方法、分析的中期分裂相数目、结果评价方法。（4）结果 受试物最高剂量的确定及试验结果：细胞毒性的测定（建议的表格见表1）；溶解情况（建议的表格见表2）；对pH和渗克分子（osmolality）浓度的影响（如果有影响）。 各处理组和对照组染色体畸变率（建议的表格见表3）。 本实验室的阳性对照组和阴性对照组（常用溶
13、剂，如DMSO）在本实验室历史上的染色体畸变率范围、均值和标准差（说明样品数）。（5）结论。表1 受试物对细胞的毒性受试物浓度g/mL活细胞计数法分裂指数法细胞覆盖程度接种细胞数/mL活细胞数/mL存活率%计数细胞数中期分裂相数分裂指数表2 受试物在所选溶剂中溶解情况记录受试物浓度g/mL溶剂名称有否沉淀（轻微可见）表3 受试物的检测结果 组 别终浓度g/mL观察细胞数畸变细胞数畸变率（%）+S9-S9+S9-S9+S9-S9阴性对照受试物阳性对照8 结果解释阳性结果表明受试物引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变。 阴性结果表明在本试验条件下，受试物不引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变。117
