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1、实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法）一、实验目的1、制作蛋白质浓度标准曲线；2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。二、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用 的蛋白质快速定量方法。该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝 G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结 合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含 量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min
2、左右的时 间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。Bradford 法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质 少。此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、rit on X-100、 SDS 和 0.1N 的 NaOH。三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250 ；无水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。2、器材：滤纸；烧杯；漏斗；可见分光光度计；试管。四、实验方法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5 ml无水乙醇后，再加入100 ml 85
3、%的磷酸， 加MiliQ水定容至1 L,过滤备用。2、标准蛋白溶液的稀释 取10支试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样 品的编号为8、 9、 10号管。3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值 OD595。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即 用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。4、标准曲线制作以标准蛋白的量（mg）为横坐标，吸光值OD595为纵坐标作图，即得一条标准曲线。由 此标准曲
4、线，求得趋势线以及公式（y二ax+b,其中y为吸光度值OD595,x为蛋白质的 量，a和b为常量）并给出R2值，R2值越接近1证明曲线越接近实际结果，根据此公式 及未知样品的吸光度值,计算每管中加入的未知蛋白的量,进而推算其浓度。5、本实验采用的未知样品为麦曲中糖化酶分离纯化实验所得的粗酶液样品。五、 实验结果记录0%记录表管号12359545678910标准蛋白质（ml）00.010.020.040.060.080.10MiliQ (ml)0.10.090.080.060.040.020考马斯亮蓝G-250溶液（ml）5555555555每管中蛋白 质的量（mg）00.010.020.040
5、.060.080.10光吸收值（OD595）未知蛋白浓 度（mg/ml）/标准曲线图标准曲线：R2值：实验二、糖化酶酶活测定一、实验目的1、了解糖化酶酶活力单位的定义、测定原理；2、掌握糖化酶酶活测定的方法。二、实验原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解c-1,4葡萄糖苷 键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘， 再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。1g固体酶粉（或1 ml液体酶），于40C。， pH=4.6的条件下，1 h分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U/g或 U/ml表示。三、试剂与器材1
6、、试剂乙酸-乙酸钠缓冲液（0.05 M, pH=4.6）; 0.05 M硫代硫酸钠标准溶液；0.1M碘溶液；200 g/L NaOH溶液；0.1M NaOH溶液；2 M硫酸溶液；20 g/L可溶性淀粉溶液（现配）。 2、器材恒温水浴锅；秒表；比色管；碘量瓶，滴定管。四、实验方法1、糖化酶反应阶段：于甲、乙两支50 ml比色管中，分别加入25 ml可溶性淀粉溶液（20 g/L）及5 ml乙酸 -乙酸钠缓冲液（0.05 M，pH=4.6），摇匀后于40 C水浴锅中预热5 min。在甲管中加入待测 酶液2 ml，立刻摇匀，在此温度下反应30 min，两管中立即加入200 g/L氢氧化钠溶液0.2 m
7、l，摇匀，终止反应，迅速取出冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2 ml。2、碘量法测定葡萄糖含量阶段：吸取上述反应液与空白液各5 ml，分别置于碘量瓶中，准确加入0.1M碘溶液10 ml， 再加入0.1M氢氧化钠溶液15 ml，边加边摇匀，密塞，于暗处静置反应15 min，取出，加 2 M硫酸溶液2 ml。3、滴定阶段：上述反应液立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失呈无色，即为其终点。 注：不同稀释倍数，应做相应的空白试验。4、酶活力计算40C。、pH4.6下，1小时水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位。 X二（A-B）xcx90.05x32.2/5x1/2xnx
8、2=579.9x（A-B）xcxn （A-B）在 3-6 ml 为宜式中：X样品的酶活力，u/ml ；A-空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml ；B-样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml ；c硫代硫酸钠标准溶液的浓度；90.05-与1 ml硫代硫酸钠标准溶液相当的葡萄糖的质量（以克表示）； 32-2反应液的总体积，ml ；5吸取反应液的体积，ml ；1/2-吸取酶液2 ml，以1ml计；n酶稀释倍数；2-反应30min,换算成1h的酶活力系数。所得的结果表示至整数；平行试验相对误差不得超过2%五、实验结果记录待测酶液的糖化酶酶活分析稀释倍数n滴定所用的硫代 硫酸钠溶液的体 积（ml）A （
9、乙管）B1 （甲管）B2 （甲管）（A-B平均值）样品的酶活力（U/ml）实验三、绍兴黄酒麦曲中糖化酶的分离纯化一、实验目的1、熟悉蛋白质的分离纯化基本步骤，加深对相关知识的理解； 2、增强综合实验的设计、协调能力；3、掌握蛋白质纯化各基本实验操作技能。二、实验原理 离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂、纤维素、葡聚糖、醇脂糖等， 它的分子中含有可解离的基团，这些基团在水溶液中能与溶液中的其他阳离子或阴离子起交 换作用。虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液， 平衡不断按正方向进行，直至完全。因此可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来。同 理，当一定
10、量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而波度逐渐减少，因此可 以全部被交换 并吸附在树脂上。如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上，用洗 脱液洗脱时，被洗脱的能力则取决于各自洗反应的平衡常数。蛋白质的离子交换过程有两个 阶段吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的蛋白质可以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离而更多的是通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换 剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。不同蛋白质与离子交换剂之间的形成 电键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分 逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。凝胶层析又称
11、为凝胶排阻层析、分子筛层析等。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶 颗粒，其内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小组分的样品进入凝胶 层析住后，各组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子 大小。比孔穴孔径大的分子不能够扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外 的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子 则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大 小介于两者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们的分子大小，所以它们流 出的时间介于两者之间，分子越大的组分越先流出
12、，分子越小的组分越后流出。这样样品经 过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。三、试剂和器材1、试剂麦曲，0.5%NaCI，硫酸铵，DEAE-纤维素，Sephadex G-75, 40 mM磷酸二氢钠-柠檬酸缓 冲液（pH6.0）。2、器材 烧杯，磁力搅拌器，转子，水浴锅，层析柱，橡皮管，夹子。四、实验方法1、粗酶液的制备将麦曲样本以1:3加入0.5%NaCl溶液中，于30 C。浸提4h，滤纸过滤，滤液即为粗酶 液G1，并量取初始粗酶液体积VI。2、硫酸铵沉淀粗酶液G1 上清液中缓慢加入硫酸铵至10%饱和度,4 C。静置1 h,1,0000xg离心15 mi
13、n 以除去部分杂质蛋白，收集上清。上清液中继续缓慢加入硫酸铵至70%饱和度，4 C。静置1 h, 1,0000xg离心15 min, 弃上清，收集沉淀。向离心管中加入少量(约3 ml) 40 mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，轻轻 摇晃，使沉淀复溶，装入透析袋中，置于40 mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中， 4 C。透析搅拌过夜，以脱去酶液中的大量硫酸铵，期间更换两次透析液。最终获得粗酶液 G2,并量取体积V2。附透析袋处理方法：将透析袋于沸水中煮5 min后用清水洗净，扎紧下口，检查不漏水 后，将硫酸铵沉淀复溶后的粗分离酶液全部装入透析袋中，排除空气，扎紧上口。注
14、意：透 析袋要预留空间，因透析时酶液体积会变大。3、DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化糖化酶DEAE-纤维素的工作pH范围为pH2-9，采取增加离子强度的方式进行洗脱，由于无梯 度混合器，因此采取直接更换洗脱液,氯化钠浓度从0 M增加到1 M，洗脱液体积为200 ml。(1) DEAE-纤维素的预处理DEAE-纤维素以干态形式出售，使用前用蒸馏水充分溶胀，加热能加快其溶胀。DEAE-纤维素在使用前的清洗：先用0.5 M NaOH浸泡半小时，除去碱液，用蒸馏水将 交换剂洗至中性，再用0.5 M HCl浸泡半小时，然后洗至中性，再用用0.5 M NaOH浸泡半 小时，最后洗至中性即可。(2) 装柱
15、 用缓冲液将层析柱底部死空间内的空气排空。预处理的离子交换剂放置在烧杯中，使得交换剂：上清液(V/V) =2:2，轻微搅拌混匀，利用玻璃棒引流，尽可能一次性将交换级倾 入层析柱，注意液体应沿着柱内壁流下。当需要往柱内补加交换剂时，应将沉降表面轻轻搅 起，然后再次倾入，防止再次倾注时产生界面，再对装柱情况进行检查，利用透过光检查柱 床是否规整，是否有气泡或界面存在。(3) 柱子的平衡调整恒流泵速度为1.0 ml/min (20.0 rpm)，用40 mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)平衡1.5-2个床体积(约120 min)，至基线平稳。(4) 加样： 目标蛋白的吸附量不应超过柱子有效交换容量的10-20%。加样方法：进样器或注射器。加样量为3 ml，手动加样。具体操作方法如下：旋开层析柱上口，用胶头滴管吸去床上层洗脱液至距床
