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1、一.实验内容实验1 MDA（丙二醛）含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）0.25%硫代巴妥酸（纯）实验 2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝 G-25095%乙醇85%磷酸实验3： SOD（超氧化物歧化酶）酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素实验4： CAT（过氧化氢酶）活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（ PH=7.0）30% H2O2实验五：Apx（抗坏血酸过氧化物酶）活性（即ASA一P0D活性）测定所需试剂：ASA（分子量 167.12）（乙=胺四乙酸=钠）EDTANa2PBS （pH7.0） 30%H20实验6： ASA（
2、维生素C）含量测定偏磷酸95%乙醇磷酸 4% 2,2-二联吡啶FeCl3 （或FeCl36H20）实验7： GSH（谷胱甘肽，媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物）含量测 定所需试剂：NaH2PO4 2H2O DTNB （二硫代硝基苯甲酸）PBS （PH6.8）实验 8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸 甲苯 茚三酮 冰乙酸85%磷酸试验 9：叶绿素含量测定。80%丙酮试验 9： GR 活性测定试验 10：过氧化氢含量测定。三氯乙酸试验 11：超氧阴离子含量测定二酶液和母液提取1. 酶液提取所需试剂： 50mmol/L 磷酸缓冲液（ PH=7.8） （内含 1%
3、（m/v） 聚乙烯吡哆烷酮 PVP）， 0.1mmol/LEDTANa 或 EDTA） ，也可为（内含 2% （m/v）PVP），0.2mmol/L EDTA Na 或 EDTA （先配制后用缓22冲液定容）2. ASA . GSH 母液提取所需试剂：5%偏磷酸1 抗氧化酶酶液提取（SOD .POD. CAT）：1g （根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）I4C冷冻15000g离心20分钟I上清液即为酶液（5C下保存一两天内备用，中短期用-20C保存）2ASA . GSH 母液提取：0.1g 叶片加入 3ml 预冷 5%偏磷酸溶液I4
4、C冷冻14000g离心10分钟I上清液即为母液（5C下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护 ASA）酶液提取所需试剂：PVP （聚乙烯吡哆烷酮）：1% （1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBSEDTA-Na : 0.1mmol/L （37.2mg EDTA-Na 溶于 1000ml 蒸馏水） ，此处用 PBSPBS （缓冲液）配制方法：NHPO412H20 NaHP042H20 取71.64g,蒸馏水定容至IL,，取31.21g定容至1l,放置4C冰箱备用PH=7.8 取 91.5ml+ & 5ml=100ml （浓度 0.2mol/L）需要 0.05mol/L将上
5、述溶液烯释至 400ml（0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60C）偏磷酸有剧毒 （偏磷酸难溶解,先得用研钵提前研碎,后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO，所以需称65.7895g，定容至500ml）三实验步骤 实验 1：MDA 含量测定1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸（纯）称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁
6、力搅拌 器上微热）1.2 步骤：取 0.3g 叶片，加 4ml 磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液（摇匀95C加热15分钟（快速冷却 3000g离心15分钟I取上清测定OD532, OD600，OD450值I按公式求MDA 浓度=6.45 X（OD -OD ） -0.56OD（umol/L）532600450可溶性糖浓度=11.71XOD （mmol/L）450最后计算MDA 含量（umol/g FW） = 4X（MDA 浓度 x）X 10-3/0.1同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW） = 4X（可溶性糖浓度x）X10-3/0.1（
7、用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入） 注意：以 0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定DA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0 （较好）ml。2. 硫代巴妥酸溶液改为0.5%的硫代巴比妥酸（溶于20%的三氯乙酸）溶液。实验 2：可溶性蛋白含量（参照 Bradford 方法测定），以 BSA 作为标准蛋白（牛血清蛋白）2.1所需试剂及配制：牛血清蛋白（BSA），考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%磷酸考马斯亮蓝G-250蛋白染色剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 9
8、5%乙醇，加入100ml 85%的磷酸，最后蒸馏水定容到1L， 混匀，放置过夜，过滤后贮放在棕色瓶中，常温下可放置一个月。标准曲线制作： 标准溶液配制：称取10mg牛血清蛋白标准液，溶于蒸馏水，定容至100ml,制成100u g/ml的标准液， 4C下保存备用（必须是牛血清蛋白向水中溶解，不能颠倒） 取6支具塞试管（10ml）,按下表配制含0-100u g/ml的牛血清蛋白液各1ml （调零管） 123456蛋白标准液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20蛋白含量（ug）020406080100 各试管加入5ml G-250染色剂，翻转混合，放置
9、2分钟，595nm比色，绘制过原点标准曲线（方 程式）（相关系数要两个9以上）2.2 步骤： 标准曲线（参考邹琦）（595nm比色）注意：制作通过原点的标准曲线，以含Oug蛋白质液调零 取0.1g样品，加5ml蒸馏水提取，5000g离心10分钟，取上清lml测定 lml样液+5ml G-250液盖塞翻转混合数次，最后595nm比色，直接从标准曲线读含量。 （此方法反应十分迅速， 2 分钟即达到平衡，其结合物在室温下 1 小时内保持稳定）实验 3：SOD 酶活性3.1 步骤：1. 取50 P l酶液 加入2ml 39m mol/L甲硫氨酸（Met） 2ml 0.225m mol/L NBT ,（
10、氮蓝四唑） lml 0.6m mol/L EDTA-Na?（可以配制在一个试剂瓶里） 1ml 0.012m mol/L核黄素，摇匀（现配现用）2. （人工培养箱内）4000LX日光灯下放置30分钟后，温度控制在30C，于暗处终止反应。（用大烧杯套着小烧杯，将试管放在同心圆内，每隔5min转过90度，转四次。对照（不加酶液）每次至 少对称地放 3 支，调零的不照光和不加酶液）3. 560nm处测吸光值，酶活性以抑制NBT光反应50%为一个酶活单位表示。（实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后，一次加入5ml，然后依次加入核黄素和酶液， 以不加酶液的照光管为对照。）3.2所需试剂：均以
11、50mmol/LPBS配置PH=7.8dl-甲硫氨酸（Met） 39mmol/L 1.1638g/200mlNBT 0.225mmol/L（0.01840 克）/ 100ml0.0368g/200mlEDTA-Na 0.6mmol/L 0.0223g/100ml 核黄素 2 0.012mmol/L0.0045g/L 或 0.0045g/100ml 用时稀释 10 倍各试剂溶液均在用前配置，配置好后均应避光保存，尤其是核黄素，必须随用随配，避光保存。.试验进行时一次性加5ml的反应混合液配置方法: Met + NBT + EDTA-Na200mll+200ml+100ml 2SOD酶测定时，酶液
12、量50 Pl偏少，改为100 Pl为佳，另外反应时间30分钟过长，改为20分钟适合。SOD 活性（酶单位 u/gFW） =（A0-A1）*V / A0*0.5*FW*aA0-对照照光管光吸收值； A1-样品管光吸收值。V样液总体积（ml） 5ml FW 鲜重（g） 1g a 测定用样品的量（ml） 0.1ml实验 4：CAT 活性（过氧化氢酶）4.1 所需试剂： PBS （PH=7.0） 50mmol/L （61 份 50mmol/l NaHPO 39 份 50mmol/l NaHPO ）24,24 15mmol/L HO （以 30% HO 配）2 2 2 2（取 85.2pL 30% HO
13、，以 50mmol/L PBS（PH 7.0）定容至 100ml）224.2 步骤：1. 3ml 50mmol/L PBS （PH7.0）加入 50 P l 酶液 （加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）再加入5p l 15 mmol/L H摇匀（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）。2. 240nm处作时间扫描（每0.5分钟测1次，共测3分钟）3. CAT活性以每分钟消耗1 P mol的H2O2为一个酶活单位。活性计算改动：（以每分钟OD值减少0.01为一个酶活单位u） （2005和2006年均是按OD值减少0.01算 的（以每分钟OD值减少0.1为一个酶活单位u）
14、注意：以PBS作空白调零50mmol/L实验5： APX活性（抗坏血酸过氧化物酶）（即ASAPOD活性）5.1 所需试剂：ASA （分子量 167.12）0.3m mol=0.052836 （g）（乙=胺四乙酸=钠）EDTANa?（以 PBS 配成 0.1m mol/L=0.0372 （g）/L）50m mol/L PBS （pH7.0）9m mol/L HO （以 30%HO 配制）（51 u l 30%H2O 定容至 1200ml）22计算为： K1=2.8，K2=3，K3=-1，K4=100可得到总取样（5ml酶液或1g样）的最终活性。酶活性单位为umol/g （鲜重） min以后APX
15、活性测定可参考沈文飚：抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨3 ml 反应液中含 50 mmol/L PBS, pH7. 0, 0. 1 mmol/L EDTA （或 EDTANa2）, 0. 1 mmol/L H2O2, 0. 5（或 0.3） mmol/L AsA,最后加入适量酶液（20、50、100ul均可）启动反应，连续记录测定室温下290 nm吸 收值的变化。以不加H2O2作为对照，H2O2本身对AsA的氧化作用在测定时间内由于吸收值变化太小可忽 略不计。室温下每分钟氧化1 umolAsA的酶量作为一个酶活性单位（U）（吸光系数为2. 8 mmol/L cm）5.2 步骤：1配反应液（50m mol/L PBS（pH7.0），内含 0.1m mol/L EDTANa2，含 0.3m mol/L ASA）2样品池加入3ml反应液，加入50u
