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1、乳、乳制品及饲料中三聚氰胺的测定一. 名词简介1. 三聚氰胺理化性质三聚氰胺：英文名 melamine ”，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子 式：C3N6H6 C3N3（NH2）3;分子量：126.12 ;物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味；相对密度：1570kg/m3; 熔点：在常压下，354 C分解；升华温度：300C ;溶解性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、 吡啶微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性。化学性能：三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐；在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐
2、步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸 一酰胺和三聚氰酸； 三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具，防火纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂。2. 乳制品是指以生鲜牛（羊）乳及其制品为主要原料，经加工而制成的各种食品。本标准所指的乳制品包括液体乳类（杀菌乳、灭菌乳、酸牛乳、配方乳）、乳粉类（全脂乳粉、脱脂乳粉、全脂加糖乳粉和调味 乳粉、婴幼儿乳粉、其他配方乳粉）、含乳饮料类、炼乳类（全脂无糖炼乳、 全脂加糖炼乳、调味炼乳； 配方炼乳）、乳脂肪类（稀奶油、奶油、无水奶油）、干酪类（原干酪
3、；再制干酪）、乳冰淇淋类（乳 冰淇淋、乳冰）和其他乳制品类（干酪素、乳糖、乳清粉、浓缩乳清蛋白）等。二. 高效液相色谱法测定1. 原理试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤得到测试液，经高效液相色谱测定，根据保留时间和紫外 吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。2试剂方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为GB/T 6682-2008中一级用水，溶液为水溶液。2.1 磺基水杨酸。2.2 柠檬酸。2.3 辛烷磺酸钠：高效液相色谱离子对试剂。2.4 乙腈：色谱纯。2.5 盐酸。2.6 60 g/L磺基水杨酸：称取 60 g磺基水杨酸用水定容至 1 L。2.7 0.1 mol/L盐酸：量取8.3
4、 mL盐酸用水稀释至 1 L。2.8 缓冲液：柠檬酸和辛烷磺酸钠浓度均为10 mmol/L。2.9 三聚氰胺标准品：已知含量大于99%。2.10标准储备液：称取三聚氰胺标准品0.01 g （准确至0.0 001g）,用甲醇配制成浓度为1mg/mL标准储备液。2.11标准系列：将标准储备液用 0.1 mol/L盐酸逐级稀释至 0.25 曲/mL , 0.50旧/mL,1.00 （g/mL , 2.00 （jg/mL , 4.00 （g/mL, 5.00 /mL , 10.0 /mL 的系列标准溶液。3 仪器成套性3.1 高效液相色谱仪3.1.1 P3000型 高压输液泵3.1.2 UV3000
5、紫外检测器3.1.3 Rehodyne手动进样阀（20卩I）3.1.4 CXTH3000 色谱工作软件3.1.5 ODS （VenusilASB-C18 色谱柱） 250 mm X 4.6 mm, 5 呵3.1.6 分析启动工具包3.1.7 溶剂托盘3.1.8 试剂包3.1.9 保护柱和柱芯3.1.10 真空固相萃取装置（含混合型的阳离子交换柱 10根）3.2溶剂过滤器（含真空泵）3.3超声波清洗器3.4柱温箱3.5高速离心机：转速 4 000 r/min3.6旋涡混匀器3.7分析天平：感量 0.1mg4样品处理4.1固态乳制品称取1.0 g左右试样（准确至 0.0 001 g）,加入0.1
6、mol/L盐酸约15 mL,涡旋混匀，超声提取 30 min后加入60 g/L磺基水杨酸6 mL 8 mL ,用0.1 mol/L盐酸定容至25 mL,混匀后离心，上清液经 0.45 m的微孔滤膜过滤后进样。4.2 液态乳制品（包含酸奶）称取15 g左右试样（准确至 0.0 001 g）,加入60 g/L磺基水杨酸 3 mL4 mL ,用0.1 mol/L盐酸 定容至25 mL ,混匀后离心，上清液经0.45 m的微孔滤膜过滤后进样。4.3 饲料称取1.0g左右试样（准确至0.0 001 g）,将样品用研钵充分碾碎混匀，加入0.1 mol/L盐酸约15 mL ,涡旋混匀，超声提取 30 min
7、 后加入 60 g/L 磺基水杨酸 6 mL 8 mL ，用 0.1 mol/L 盐酸定容至 25 mL ， 混匀后离心，上清液经0.45 m的微孔滤膜过滤后进样。5 测定步骤5.1 色谱条件5.1.1 色谱柱：ODS 或 C8, 250 mm X 4.6 mm, 5 pm。5.1.2 流动相：缓冲液：乙腈=85 ： 15。5.1.3 流速：1.0 mL/min。5.1.4 柱温：40 C。5.1.5 波长：240 nm。上述色谱条件是典型的, 可根据实际情况做具体调整。如果分离效果不理想,将水相改为：柠檬酸和辛烷磺酸钠浓度均为10 mmol/L，加3mL三氯乙酸，配制成1000mL溶液，流动
8、相用氨水调 PH值3.9到 3.95。5.2 测定5.2.1 标准曲线制备将标准系列 0.25 用/mL , 0.50(jg/mL, 1.00 曲/mL, 2.00 (g/mL, 4.00 (g/mL , 5.00 (g/mL , 10.0(jg/mL分别进样20(L,以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图，制作标准曲线。5.2.2 样品测定取制备好的试样溶液进样20山,进行液相色谱分析。根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰1,液态奶样品色谱图见图2，奶粉样品色谱图见图 3。面积进行定量。三聚氰胺的标准样品色谱图见图仪器：山东金普分析仪器有限公司LC3000色谱柱：山东金普分析仪器有限公司OD柱
9、250 mmx 4.6 mm, 5卩m流动相：缓冲液：乙腈 =85 ： 15,用三氯乙酸调PH3.9流速：1.0 mL/min图1标样色谱图柱温：40 C波长：240 nm图2液态奶样品色谱图仪器：山东金普分析仪器有限公司LC3000色谱柱：山东金普分析仪器有限公司0D柱250 mmx 4.6 mm, 5卩m流动相：缓冲液：乙腈 =85 ： 15,用三氯乙酸调PH3.9流速：1.0 mL/min柱温：40 C波长：240 nm图3奶粉样品色谱图仪器：山东金普分析仪器有限公司LC3000色谱柱：山东金普分析仪器有限公司OD柱250 mmx 4.6 mm, 5卩m流动相：缓冲液：乙腈 =85 :
10、15,用三氯乙酸调PH3.9流速：1.0 mL/min柱温：40 C波长：240 nm6结果计算6.1 计算试样中三聚氰胺的含量（mg/kg）按式（1）计算：Cx V(1)X =m式中：X 样品中三聚氰胺含量，mg/kg ;C 从标准曲线上查出的含量，（jg/mL ；V 定容体积，mL;m称样量，g。平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。本文参考以下方法：HPLC-UV检测方法按照三聚氰胺在传统的 C18 柱上保留很差， 需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离， 美国食品药品监督管理局（FDA的三聚氰胺检测方法和中国农业部颁部的三聚氰胺检测方法，采用北 京创新通恒科技有限
11、公司的 ODS C18色谱柱，能够得到良好的结果。1、三聚氰胺的FDA检测方法色谱柱：山东金普分析仪器有限公司ODS4.6 X 250mm缓冲液：10mM宁檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调 pH为3.0。流动相：缓冲液：乙腈 =85： 15进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL,进10卩L,进样前用0.22卩m针式过滤器过滤流 速： 1.0mL/min柱温：40 C波 长： 240nm2、三聚氰胺的中国农业部颁标准检测方法 色谱柱：山东金普分析仪器有限公司 ODS4.6X250mm 缓冲液：10mM宁檬酸,10mM庚烷磺酸钠流动相：缓冲溶液 :乙腈 =85:15进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL，进10uL进样前用0.22卩m针式过滤器过滤流速：1.0mL/min柱温：40 C波长：240nm山东金普分析仪器有限公司 技术部#
