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1、Western印迹法 这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其
2、生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10分离胶、4浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、4XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、封闭液、PBST、PBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、抗体、化学发光试剂。杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器
3、；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（2020cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液一 SDS-PAGE电泳10SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml溶解后，4保存，保存时间为1周。1.5mol/L TrisHCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
4、0.5mol/L TrisHCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。40Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g超纯水至 100ml37下溶解后，4保存。使用时恢复至室温且无沉淀。（二）使用液单去污剂裂解液（50mmol/L TrisHCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100mg/ml PMSF）： 1mol/L TrisHCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTri
5、tonX100 0.5ml蒸馏水至 50ml 混匀后， 4保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。 PBS（ pH 7.2-7.4）KH2PO4 0.27gNa2HPO4 1.42gKCl 0.2gNaCl 8g 蒸馏水至 800ml用浓盐酸调PH至7.5定容至1L PBST : 及含 0.05% -0.5(0.2%)TWEEN-20的PBS 封闭液: 及含 5% 脱脂奶粉的 PBST G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用） 考马斯亮蓝G250： 100mg 95乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸馏水至 1000
6、ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4保存。15分离胶和5浓缩校 15分离胶 5浓缩胶超纯水 920ml 980ml40Acr/Bic（37.5：1） 2ml 267ml1.5 mol/L TrisHCl（pH8.8） 1ml 0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） 300ml10SDS 40 ml 17 ml10%AP（过硫酸胺） 40ml 17 mlTEMED 4 ml 3.5 ml 加TEMED后，立即混匀即可灌胶。4样品缓冲液 还原型(10ml): Tris 0.303 g -巯基乙醇 2 ml SDS 0.8 g 溴酚兰 0.002
7、 g 甘油 4 ml 浓盐酸 189 l 加超纯水定容至10ml。 用微量离心管分装后，冻存。 非还原型（10ml）： Tris 0.303 g SDS 0.8 g 溴酚兰 0.002 g 甘油 4 ml 浓盐酸 189 l 加超纯水定容至10ml。用微量离心管分装后，冻存。 混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存。电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.19mmol/L甘氨酸，0.1 SDS） Tris（MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 14.4gSDS 1g蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用35次。转移缓冲液（25mmol/L Tris
8、，19mmol/L甘氨酸，20甲醇）甘氨酸（MW75.07） 14.4gTris（MW121.14） 3.03g 甲醇 200ml蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用35次。封闭液（含5脱脂奶粉的PBST缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g PBST 100ml溶解后4保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。洗脱抗体缓冲液: PBST冰乙酸 12.6ml硼酸 7.5g钾明矾 15g（水温冷至30以下时再加入）加水定容至1000ml，室温保存抗体 用PBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5mlDAB显色试剂盒购自北京中彬金桥公司，分A,B和C三种试剂。操作步
9、骤：（一） 蛋白样品制备（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、 每瓶细胞加3ml 4预冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、 按1ml裂解液加10 ml PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、 每瓶细胞加400 ml含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
10、5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、 于4下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于20保存。（2） 组织中总蛋白的提取：1、 将少量组织块置于12ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2、 加400 ml单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于20保存。（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。2
