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1、基因工程的基本知识(一) 基因工程的基本工具1. “分子手术刀”限制性核酸内切酶(限制酶)(1) 来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2) 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，在特定部位的磷酸二酯键处 切割，因此具有专一性。( 3 )结果：黏性末端和平末端。2. “分子缝合针”DNA连接酶(1) 两种DNA连接酶(EcoliDNA连接酶和T DNA连接酶)的比较：4- 相同点：都缝合磷酸二酯键。 区别：EcoliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而TDNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效 4率较低。与DNA
2、聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端， 形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。3. “分子运输车”载体(1) 载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。 具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(2) 最常用的载体是质粒，本质是双链环状DNA分子(质DNA)。(3) 其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒(二) 基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1. 目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。2. 原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方
3、法有反转 录法_和化学合成法_。3. PCR 技术扩增目的基因( 1)原理： DNA 双链复制(2) 过程：第一步(变性)：加热至9095CDNA解链；第二步(复性)：冷却到5560C, 引物结合到互补DNA链；第三步(延伸)：加热至7075C，热稳定DNA聚合酶从引物起 始互补链的合成。(3) 条件：引物、模板、酶、原料、能量、适宜的温度和PH值第二步：基因表达载体的构建1. 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达 和发挥作用。2. 组成：目的基因启动子终止子标记基因(1) 启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。(2) 终止子：也是一
4、段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。(3) 标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的 细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞1. 转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2. 常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉 管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传 物质相对较少 ，最常用的原核细胞是
5、 大肠杆菌 ，其转化方 法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞 ，再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在 一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。3. 重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达 目的基因成功插入的基础：遵循碱基互补配对原则；粘性末端相同；具有相同的化学结构第四步：目的基因的检测和表达1首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交 技术。2其次还要检测目的基因是否转录出了 mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与mR NA 杂交。3. 最后检测 目的基
6、因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原抗体杂交。4. 有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 目的基因成功表达的基础：具有一套相同的遗传密码。（三）基因工程的应用1. 植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2. 动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。3. 基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。4. 微生物在基因工程领域中的重要作用： 工具酶主要来自微生物； 最重要的目的基因供体库之一； 目的基因的载体之一； 作为受体细胞； 提供用于发酵的工程菌（四）蛋白质工程第二代基因工程1.与基因工程合成的蛋白质的主要区别是 基因工程只能合成自然界已存在的蛋白质，而蛋 白质工程可合成一些自然界中原本不存在的蛋白质 。2蛋白质工程的基本途径中 预期蛋白质功能 一 设计蛋白质结构 一 推测氨基酸序 列-找出对应的脱氧核苷酸序列。
