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1、基因工程的基本知识(一) 基因工程的基本工具1. “分子手术刀”限制性核酸内切酶(限制酶)(1) 来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2) 功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,在特定部位的磷酸二酯键处 切割,因此具有专一性。( 3 )结果:黏性末端和平末端。2. “分子缝合针”DNA连接酶(1) 两种DNA连接酶(EcoliDNA连接酶和T DNA连接酶)的比较:4- 相同点:都缝合磷酸二酯键。 区别:EcoliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而TDNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效 4率较低。与DNA
2、聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端, 形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端,形成磷酸二酯键。3. “分子运输车”载体(1) 载体具备的条件:能在受体细胞中复制并稳定保存。 具有一至多个限制酶切点,供外源DNA片段插入。 具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。(2) 最常用的载体是质粒,本质是双链环状DNA分子(质DNA)。(3) 其它载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒(二) 基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的获取1. 目的基因是指: 编码蛋白质的结构基因 。2. 原核基因采取直接分离获得,真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方
3、法有反转 录法_和化学合成法_。3. PCR 技术扩增目的基因( 1)原理: DNA 双链复制(2) 过程:第一步(变性):加热至9095CDNA解链;第二步(复性):冷却到5560C, 引物结合到互补DNA链;第三步(延伸):加热至7075C,热稳定DNA聚合酶从引物起 始互补链的合成。(3) 条件:引物、模板、酶、原料、能量、适宜的温度和PH值第二步:基因表达载体的构建1. 目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达 和发挥作用。2. 组成:目的基因启动子终止子标记基因(1) 启动子:位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位。(2) 终止子:也是一
4、段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端。(3) 标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的 细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步:将目的基因导入受体细胞1. 转化的概念:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2. 常用的转化方法:将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是 农杆菌转化法,其次还有 基因枪法和 花粉 管通道法等。将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。 将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传 物质相对较少 ,最常用的原核细胞是
5、 大肠杆菌 ,其转化方 法是:先用 Ca2+ 处理细胞,使其成为 感受态细胞 ,再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在 一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。3. 重组细胞导入受体细胞后,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达 目的基因成功插入的基础:遵循碱基互补配对原则;粘性末端相同;具有相同的化学结构第四步:目的基因的检测和表达1首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交 技术。2其次还要检测目的基因是否转录出了 mRNA,方法是采用用标记的目的基因作探针与mR NA 杂交。3. 最后检测 目的基
6、因是否翻译成蛋白质,方法是从转基因生物中提取 蛋白质,用相应的 抗体进行抗原抗体杂交。4. 有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 目的基因成功表达的基础:具有一套相同的遗传密码。(三)基因工程的应用1. 植物基因工程:抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。2. 动物基因工程:提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。3. 基因治疗:把正常的外源基因导入病人体内,使该基因表达产物发挥作用。4. 微生物在基因工程领域中的重要作用: 工具酶主要来自微生物; 最重要的目的基因供体库之一; 目的基因的载体之一; 作为受体细胞; 提供用于发酵的工程菌(四)蛋白质工程第二代基因工程1.与基因工程合成的蛋白质的主要区别是 基因工程只能合成自然界已存在的蛋白质,而蛋 白质工程可合成一些自然界中原本不存在的蛋白质 。2蛋白质工程的基本途径中 预期蛋白质功能 一 设计蛋白质结构 一 推测氨基酸序 列-找出对应的脱氧核苷酸序列。