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1、实验三 分子筛凝胶层析一、实验目的1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理； 2学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。二、实验原理凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。目前关于 凝胶层析的原理有许多假设和理论，普遍接受的是分子筛效应。凝胶颗粒在合适的溶剂中浸 泡，充分吸液膨胀，然后装入层析柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗 脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进 入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不 同的物质得到分离。对凝胶层析分离的简单过程可用图1 表示。f 大分子小
2、分子凝胶颗粒图 1 小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过本实验是分子筛凝胶过滤法的初步训练，采用葡聚糖凝胶G-25，以水为洗脱溶剂，层 析分离大分子红葡聚糖和小分子维生素b12。三、试剂和器材 试剂1 蓝葡聚糖-b12混合液2 葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 器材1 层析柱：柱管（1厘米x20厘米），附有一小段乳胶管及螺旋夹2 洗脱瓶（下口锥形瓶，250mL）3 试管及试管架4 量筒（10mL）5 721 分光光度计四、操作（一）凝胶的预处理（教师准备）为使样品通过凝胶时具有良好的流速并能很好的分离，应对凝胶进行预处理。 （1）凝胶必
3、须于使用前在过量的溶剂中充分地膨胀。 （2）用倾泻法除去混杂的细小颗粒，重复3-4 次。 在膨胀时间内，应避免剧烈搅拌，以防止破坏交链结构。（二）柱的选择为了防止分离受管壁效应影响，一般应选用内径大于2.5 厘米的柱。为了便于组织拆卸， 下口可取一个适当削磨过的橡皮塞倒插入管底，这种装法亦可避免层析柱的死区而有利分 离。橡皮塞上还覆盖一层尼龙绸或脱脂棉，以防止葡聚糖颗粒流出。（三）装柱 装柱是凝胶层析中最重要的一步操作，实验时必须将凝胶床装得十分均匀。首先，将柱 垂直地安装好。层析柱下端及尼龙绸必须充以溶剂，不能留有气泡，然后，将已膨胀的凝胶 沿着玻璃棒小心地徐徐灌到柱中，尽量一次装完，以免出
4、现不均匀的凝胶带，为此在装柱时 需打开下口，并调节适应的流速。灌注时，凝胶悬浆切不可太稀或太粘。若太稀，分几次装 出的凝胶床往往不是均匀的，过于粘稠，会吸留气泡。（四）加样 打开柱的下口，让溶剂（水）逐渐流出。待到床面上只留下极薄的一层溶剂时，关闭 出口管上的螺旋夹。用吸量管取 3-5 滴混合液，小心地将此样品加到凝胶床的表面上。注意加样时勿将床面 凝胶冲起，亦不要沿柱壁滴加样品，因为这样样品易从柱壁与凝胶床之间漏下。然后，打开出口管，待样品恰好进入床后，用少量水冲洗一下凝胶表面和接触过样品 的柱壁，待安全流进床内后，再加水进行扩展洗脱。在全部操作期间，要避免柱床流干。（五）洗脱加蒸馏水洗脱，
5、用小量筒收集洗脱液，用螺旋零部件调节洗脱速度为0.5l.OmL/分，每 次ImL,依次倒入已预先编好号码的试管中，观察并记录洗脱中的现象。收集15管左右，先收集的一部分溶液呈蓝色，后收集的一部分溶液呈红色。每管加入蒸馏水1mL,稀释1倍，倒入0.5厘米厚的比色皿中，于分光光度计测定光密 度，蓝色溶液部分在680nm波长下测定，红色溶液部分再520nm波长下测定。以mL数（或 管数）为横坐标，绘出洗脱曲线。五、实验结果与讨论编号12345678蓝 680nm0.1210.2420.072红 520nm0.1310.2190.3160.2970.2410.172编号9101112131415蓝 6
6、80nm红 520nm0.1090.0670.0410.0310.0110.0140.007擬胶层析洗脱曲线样品试管序号1利用凝胶层析法分离混合样品时，怎样才能得到较好的分离效果？答：装柱时要注意凝胶的流速，不宜过快，同时要保证凝胶能充分的沉淀且分 布的比较均匀，分离柱加样头部凝胶需保持水平。凝胶溶胀所用的溶液应与洗 脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。 样品的浓度和加样量的多少是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但 大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度 与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体
7、积的 1%-2%，制备用量一般为柱床体积的 20%-30%。2比较凝胶层析与纸层析在实验原理上的区别。纸层析法又称纸色谱法，是用滤纸为支持物，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成 滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是 固定相，有机溶剂是流动相。将样品点在滤纸上进行展层，样品物质在两相溶剂中不断进行 分配。由于它们的分配系数不同，随流动相移动的速率就不同，于是就将这些物质分离开来。凝胶层析是利用分子筛效应来分离分子大小不一的物质大分子不能进入凝胶内部而沿 凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓 慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
