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1、实时荧光定量 PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出， 由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比， 它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前 已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。一. 实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基 团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量分析的方法。1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念一一Ct值。C代 表 Cycle， t 代表 t
2、hreshold， Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达 设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。图1. Ct值的确定2荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省 设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线 性关系1，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可 作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2 所示）。因此，只要获得未知样品的C
3、t值，即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。图 2. 荧光定量标准曲线4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。 现将其原理简述如下：1） TaqMan 荧光探针：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一 寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整 时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5 3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同
4、步。如图3所 示。图 3. TaqMan 荧光探针工作原理2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地 掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发 射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。二内标在传统定量中的意义1几种传统定量PCR方法简介：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合 成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被 扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可 用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光
5、强度，以内标为对照定量待检 测模板4。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应 管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标 记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片 段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数5。3) PCR-ELISA 法: 利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合， 再加入抗地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCRELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标
6、准曲线, 也可实现定量检测目的6。2内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR 经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR 仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终 点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的 不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的 方法。图4.相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性三内标对荧光定量PCR的影响1实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了
7、传统定量只能终点检测的局限， 实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通 过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光 定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1） Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同 时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（见图4）2） Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进 行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。2内
8、标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双 重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模 板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著7,8。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内 标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量 的方法。美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比 较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准 曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方9。Applied Biosystems 公司的 7
9、700 型实时荧光定量 PCR 仪是全球公认的荧 光定量 PCR 的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外 标准曲线的方法，而不用内标进行定量。综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量 PCR 是迄今为止定量最准 确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、 转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域10,11,12,13。参考文献1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotech
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16、近一条直线，这样的直线 即是基线。荧光域值(threshold)的设定：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 第315个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。CT值：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该 模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标 准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的 CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线判断扩增曲线是
