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1、学科分类号 0818 本科生毕业论文题目 ： 芽胞杆菌的净水作用的研究Study of Bacillus on Water Purification Functions 学生： 汨 学号：0912402007系别：生命科学系专业：生物工程指导教师： 胜贵 教授起止日期：2012.3 2013.5 2013年 5月12 日 / 学院本科毕业论文(设计)诚信声明作者重声明：所呈交的本科毕业论文(设计)，是在指导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的容外，论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的成果。对论文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明
2、确的方式标明。本声明的法律结果由作者承担。本科毕业论文（设计）作者签名：年 月 日目录摘 要I关键词IABSTRACTIKEY WORDSII1 前言12 材料与方法32.1 实验材料32.1.1 研究材料32.1.2 实验药品42.1.3 实验仪器42.1.4 培养基42.2 实验方法52.2.1 筛选芽胞杆菌52.2.1.1 细菌活化52.2.1.2 芽胞染色52.2.2 模拟污染水样62.2.3 投菌62.2.4 测定73 实验结果与分析73.1 氨氮的测定73.2 硝酸盐的测定93.3 COD的测定113.4 pH值的测定124 讨论14参考文献15致16芽胞杆菌的净水作用的研究摘 要
3、 本文研究芽胞杆菌对水的净化作用。从微生物实验室保藏的50多个菌株中筛选芽胞杆菌，将7株芽胞杆菌(Bacillus )投放于模拟污染水样中，再分别监测污染水中的pH值、COD 值、硝酸盐浓度、氨氮浓度等水化学指标。结果表明，在污染水中加入芽胞杆菌后，水的COD值、硝酸盐、氨氮浓度有所降低，而总碱度显著上升，pH值维持在8.008.50 之间。研究证明了芽胞杆菌对调节养殖水体微生态结构稳定具有明显的作用。关键词芽胞杆菌；COD；硝酸盐；氨氮；净水作用Study of Bacillus on Water Purification Functions AbstractThe experiment i
4、s to research the water purification functions of the Bacillus.Firstly selecting Bacillus from about 50 different kinds of strains in the microbiological laboratory, then put these seven strains into the various simulated polluted waster samples, finally, we get the result by separately testing the
5、chemical index in these water samples like pH values, COD value and the concentration of nitrogen and ammonia nitrogen.The results that Bacillus are transferred into the water samples, comparing with the decrease of the concentration of the COD value and nitrogen, the total alkalinity has dramatical
6、ly increased and the pH value maintain the range from 8.00 to 8.50 shows Bacillus play a significant role in improving the quality of the farming water and keeping the stability of the structure of microbes.Key wordsBacillus; COD；nitrogen；ammonia nitrogen；purifying capacity1 前言随着水产养殖规模的不断扩大，集约化养殖程度的
7、不断提高，水产养殖池的富营养化程度越来越高1。有机物的大量投放使残饵，鱼虾的排泄物等富营养因子共存于一个水体，加上池塘自净与调节能力的降低，养殖水体中化学需氧量 (COD)、生物耗氧量(BOD)、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、硫化物等指标严重超标，池塘水质恶化，鱼虾病害频频发生2,3。抗生素在养殖池中的过量或频繁使用不仅会使细菌耐药性增加，破坏和干扰养殖环境的正常生物系统，导致养殖水体中微生物的生态失调，而且会产生二重污染，在生物体残留，严重影响水产品的品质4,5,6，使水产品的出口受到严峻的挑战。如果能有效避免有机物质与其分解产物的过量积累，就能获得良好的水质条件。正是基于这一原理，选育和培养高效
8、安全的微生物菌剂，对净化水质尤为重要。将微生物菌剂7直接投放到受污染的水体中，就能改善和恢复养殖水体的生态环境，减少鱼虾疾病的发生，达到净水的目的。芽胞杆菌作为一种真细菌8，是土壤中的优势种群，能强烈地分解含碳、氮、磷、硫等污染物，分解蛋白质和复杂多糖，对水溶性有机物分解也有重要的作用，同时可以与养殖环境中的有害藻类与水产致病菌竞争，形成优势种群，抑制有害藻类与水产致病菌。由于它的特性与功能优于光合细菌而有望成为光合细菌的替代品，已成为当前国际净水界的研究热点9。芽胞杆菌类净水微生物的使用,使养殖者在不中断养殖过程的情况下，清除长时间残留于养殖水域底部废物，尤其是池底部积累的大量残余饵料、排泄
9、废物、动植物残体以与有害气体(氨、硫化氢等)，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等)，后分解为更小分子有机物(氨基酸、低级脂肪酸、单糖、环烃等)，最终分解为二氧化碳、硝酸盐、硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD，使水体中的氨氮(NH4+-N)与亚硝酸氮(NO-2-N)、硫化物浓度降低，从而有效地改善水质。同时还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。这些浮游植物的光合作用，又为池底栖水产动物的呼吸，有机物的分解提供氧气，从而形成一个良性生态循环。由于芽胞杆菌大量繁殖，在池形成优势种群，可抑制病原微生物的繁殖，减少疾病发生。芽胞杆菌具有丰富的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、
10、脱氢酶、脱羧酶、氧化酶等，能强烈的分解含碳污染物，分解蛋白质和复杂多糖，对水溶性有机物分解也有重要的作用。养殖池塘的悬浮物(简称“絮团”)和底泥严重恶化了水环境，引起动物发病。而芽胞杆菌通过其酶的作用，能分解悬浮物和底泥，从而维持水生生态环境平衡。把芽胞杆菌投入养殖池，能降低水中COD、BOD，有效改善水质和周围环境。高密度集约化养殖给养殖池塘生态环境带来了严重的污染，过量的N、P排入水体引起池塘富营养化，在池塘也易形成对水产动物有毒性的氨氮，影响动物的生长，甚至死亡。而芽胞杆菌可利用其丰富的酶，强烈分解含氮、碳污染物，净化养殖水体。NO3-在芽胞杆菌作用下，经NO2-，NO，N2O被还原为氮
11、气，即芽胞杆菌是好氧菌和兼性厌氧菌，以分子氧为载体，在供氧不充分的时间与空间，可以利用硝酸盐为最终电子载体产生NO2-N和N2,而起反硝化作用，将硝酸盐移出系统外，提高pH。总的来说，芽胞杆菌具有强烈的分解含碳、氮、磷、硫污染物，分解蛋白质、复杂多糖、水溶性有机物的能力，已被广泛应用。 枯草芽胞杆菌（命名为4号菌株）是拜特科技制剂中的优势菌，能迅速分解水体中有机物，达到净化水的作用。通过对COD，氨氮的含量，硝酸盐的含量等指标的测定，可以确定芽胞菌株的净水能力。 比较从微生物实验室筛选出的6株芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌（4号菌株）的净水能力，找出7种芽胞杆菌中净水作用最好的菌株。2 材料与方法2.
12、1 实验材料2.1.1 研究材料本实验所用的芽胞杆菌：（1） 从微生物实验室已分离出的50种细菌中筛选出芽胞杆菌，微生物实验室已筛选出的一株超大芽胞杆菌（命名为7号菌株）。（2） 枯草芽胞杆菌（命名为4号菌株），由拜特科技提供的。2.1.2 实验药品NaOH，KI，HgI2，酒石酸钾钠（KNaC4H6O6.4H2O)，重铬酸钾（K2Cr2O7），浓硫酸，HgSO4 ，10%H2SO4，Ag2SO4 ，H2SO4，邻菲罗啉（C12HSN2H2O），硫酸亚铁铵(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O，5%孔雀绿水溶液（四甲基代二氨基三苯甲烷），0.5%番红水溶液，豆粕粉，麦麸粉，浓硫酸，碳酸钠等。2
13、.1.3 实验仪器Hach DRB 200 化学耗氧量（COD）分析仪（圣科仪器设备)，通风橱（宜兴市佳美实验装备），pH酸度计（雷磁仪器厂），AL104电子天平（Mettler-Toledo仪器公司），立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50S1，博迅实业医疗设备厂），电热恒温培养箱（DHP-2000型，市华北实验），CJ型水平层流净化工作台（洁净技术研究所制造），QYQ-1000-UL/QYQ- 200-UL移液枪（青云航空仪表生产），恒温水浴锅(HH S，江金坛市金城国胜实验仪器厂)，紫外分光光度计（T 21 P，光谱仪器），荧光显微镜(BX 60 F 5，日本)大小烧杯若干，玻璃棒，试管
14、，接种环，培养皿，酒精灯，载玻片，盖玻片，试管架，滤纸，载玻片夹子，双层瓶（装香柏油和二甲苯），擦镜纸，报纸，滴定管，锥形瓶，pH试纸等。2.1.4 培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g， NaCl 5.0 g，琼脂粉1.6%，用1 mol/L NaOH调节pH 7.0，蒸馏水定容至1 000 mL。于0.1 Mpa、121 下灭菌30 min，储存备用。2.2 实验方法2.2.1 筛选芽胞杆菌2.2.1.1 细菌活化将从微生物实验室已分离出的50种细菌，微生物实验室已筛选出的一株超大芽胞杆菌（命名为7号菌株）和拜特科技提供的枯草芽胞杆菌（命名为4号菌株），进行活化。
15、2.2.1.2 芽胞染色芽胞染色法筛选：制片，按常规方法涂片、干燥与固定。加热染色，向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5 min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。脱色，待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。复染，用0.5%番红水溶液复染2 min。水洗，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。镜检，将载玻片晾干后油镜镜检。（部分芽胞杆菌图片）（100）2号 1号5号 6号2.2.2 模拟污染水样 在一个塑料桶中装水20 L，分别加入豆粕粉和麦麸粉各12.0 g，硫酸铵1.0 g，硝酸钾6.0 g，硫化钠0.01 g，配制好的模拟养殖水用5%的碳酸钠溶液和硫酸钠调节pH值至8.0-8.5。2.2.3 投菌将筛选出来的芽胞杆菌和4号菌株与7号菌株分别编号为1，2，3，4，5，6，7号菌株。取7个1 000 mL的大烧杯，水样配制2 d之后，分别向杯中
