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1、三羟异黄酮对高转移卵巢癌细胞株HO8910PM的侵袭、转移及MTA1、nm23H1基因表达的影响【摘要】目的：研究三羟异黄酮（genistein）对人高转移卵巢癌细胞HO8910PM转移相关能力的影响及其作用的机制。方法：以台盼蓝拒染法检测genistein对高转移卵巢癌细胞HO8910PM细胞增殖的影响；用Transwell小室法检测genistein对HO8910PM细胞的侵袭能力和趋化运动能力的影响；RTPCR分析MTA1及nm23H1 mRNA的表达。结果：50mol/L的genistein作用细胞6h后能抑制HO8910PM细胞体外侵袭人工基底膜和趋化运动能力,抑制率分别为(21.0
2、83.12)和(17.152.01)；25100mol/L genistein作用HO8910PM细胞24h后，明显下调MTA1 mRNA的表达，上调nm23H1 mRNA表达水平。结论：genistein能抑制高转移卵巢癌细胞HO8910PM的侵袭和运动能力。genistein抗肿瘤侵袭转移的作用机制与MTA1 mRNA的表达下调和nm23H1 mRNA表达上调有关。 【关键词】 异黄酮；侵袭；运动；转移；卵巢癌；MTA1；nm23H1Effects of genistein on the abilities of invasion and metastasis and on the exp
3、ression of MTA1and nm23H1 mRNA in the highly metastatic ovarian carcinoma HO8910PM cells in vitro MA Weilie，DING Hang，FU Weiyu，ZHOU Keyuan （Department of Biochemistry，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，China） 【Abstract】Objecctive:To investigate the effect of genistein on the metastasis assoc
4、iated abilities of the human highly metastatic ovarian carcinoma HO8910PM cells and its possible mechanism.Methods:A trypanblue staining was used to examine the effect of genistein on proliferation of HO8910PM cells at 6 hours after the treatment；Transwell Chamber assay was performed to determine th
5、e effect of genistein on the invasive and migratory abilities of the cells；The expression level of MTA1 and nm23H1 mRNA was assessed by RTPCR analysis.Results: Genistein significantly inhibited the invasive and migratory abilities of HO8910PM cells in vitro，with inhibitory rates of (21.083.12)% and
6、(17.152.01)%, respectively, at 6 hours after the treatment with 50 μmol/L genistein; Genistein distinctly downregulated the expressions of MTA1 mRNA and upregulated the expressions of nm23H1 mRNA in HO8910PM cells treated with 25100μmol/L genistein for 24 hours.Conclusion: Genistein might inhi
7、bit the migration and invasion of HO8910PM cells in vitro possibly through reducing the expression level of MTA1 mRNA and increasing the expression level of nm23H1 mRNA, which suggests that genistein be a potential drug to inhibit tumor metastasis. 【Key words】 genistein；invasion； migration；metastasi
8、s；ovarian carcinoma；MTA1；nm23H1三羟异黄酮（genistein）是大豆异黄酮的一种重要成分，主要存在于豆类植物中，具有广泛的生物学作用，如抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗氧化、抗突变等，其中genistein抑制肿瘤的血管生成是当前的研究热点之一。MTA （matastasisassociated gene）是近年来发现的一组与肿瘤转移密切相关的基因，包括MTA1、 MTA2和MTA3等2，有研究表明MTA1在mRNA水平与多种肿瘤的侵润转移密切相关3。nm23基因(nometastatic gene 23)是steeg等4用差异克隆杂交技术,在具有不同转移潜力的7种鼠
9、K1735黑色素瘤细胞系cDNA文库中克隆出来的一种转移抑制基因。人类nm23基因有5种亚型,最早报道为nm23H1和nm23H2两个亚型5。nm23H1 mRNA表达与多种肿瘤转移有关,nm23H2 mRNA与肿瘤的关系研究较少。本文用体外实验的方法研究genistein对HO 8910PM细胞侵袭和运动能力的影响,并用RTPCR的方法检测genistein对MTA1 mRNA和nm23H1 mRNA表达的影响,探讨genistein抗肿瘤侵袭转移的可能作用机制。1 材料与方法 1.1 实验材料 人高转移卵巢癌细胞(HO8910PM)购自上海细胞生物所,由浙江省肿瘤研究所许沈华等6建立。细胞
10、在含体积分数为10%小牛血清,1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI 1640完全培养基中,37、5%CO2（体积分数）饱和湿度孵箱培养。细胞经过消化传代,取对数生长期的细胞进行培养。 1.2 药品与试剂 超级小牛血清购自杭州四季青公司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；PVPF滤膜(孔径8μm，直径13mm)购自Osmonics公司；Fibronectin购自Sigma公司；Matrigel购自BD公司；4×上样缓冲液(125mmol/L TrisHCl，pH6.8，4%SDS，10%β巯基乙醇，20%甘油，0 .04%溴酚蓝)
11、； RTPCR试剂盒购自Qiagene公司；100bpDNAmarker购自华美生物工程公司；genistein购自sigma公司,实验前用DMSO溶解,培养液稀释,DMSO终浓度为0.1(实验证明该浓度对细胞无影响)。1.3 台盼蓝拒染法测定异黄酮作用6h对HO8910PM细胞增殖的影响 选取对数生长期的HO8910PM细胞,经胰酶消化、台盼蓝染色后在血球计数板上计数,确保活细胞在97%以上。调整细胞浓度为每孔2.5×104个(每孔250μL),加到24孔培养板中。将培养板放入37、5%CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后取出培养板,加入不同浓度genistein 1μL,
12、使其终浓度分别为25、50、100、200μmol/L，每个浓度设3个平行孔；同时设置空白对照组和溶剂对照组。培养板放回孵箱继续培养6h,取出培养板,以台盼蓝活细胞拒染法计数活细胞，计算药物对细胞的增值抑制率（IR）。细胞增殖抑制率(IR%)=(对照组细胞计数处理组细胞计数)/对照组细胞计数×100%。 1.4 重组基底膜侵袭、趋化性运动实验7 将PVPF滤膜用指甲油manicure贴在Transwell小室上,风干。在膜的外表面涂纤粘蛋白Fibronectin(5g/10L),置超净台内风干,膜内表面涂基底膜成分Matrigel5μg(10μL),使之干燥,形成
13、人工重组基底膜；在24孔板内加入0.1BSA RPMI1640，每孔600μL。收集对数生长期的HO8910PM细胞,悬浮于含0.1BSARPMI1640培养基中,终浓度为1×109/L。将Transwell小室浸于24孔板的条件培养基中,每个小室加细胞悬液100μL,再分别加入不同浓度genistein 1μL,使其终浓度分别为25、50μmol/L,对照组加入等量的PBS。37、5%CO2温箱内孵育6h。将Transwell小室取出,滤膜用甲醇固定1min,苏木精染色3min,水洗,伊红染色10s,水洗,用PBS浸湿的棉签擦去滤膜内表面的细胞；用封片胶将
14、滤膜封于载玻片上,于400×显微镜下计数穿过PVPF滤膜的细胞数。每膜计数上下左右中5个随机不同视野,每组平行设3个滤膜。运动实验与侵袭实验相比,只是PVPF滤膜上不需铺Matrigel。 侵袭抑制率(IR%)=(对照组穿膜细胞数-给药组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数×100%运动抑制率(IR%)=(对照组穿膜细胞数-给药组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数×100%1.5 半定量RTPCR检测MTA1及nm23H1基因的mRNA表达 (1)总RNA的提取：分别收集以PBS、和25、50、100μmol/L genistein处理24h的HO8910PM细
15、胞，按Trizol试剂盒说明提取总RNA。(2)引物设计与合成：nm23H1引物设计参照文献8，引物序列为：sense primer：5’AGG GCA GAC CAC ATT GCT TTT C3’，antisense primer：5’GCT GGG AGG AAG CAT TTT TAA TC3，扩增产物长度为185bp。MTA1引物设计参照文献8,引物序列为：sense primer：5AGC TAC GAG CAG CAC AAC GGG GT3， antisense primer：5’CAC GCT TGG TTT CCG AGG A
16、T3，扩增产物长度为290bp。以GADPH为内参照,引物序列为：sense primer：5’ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’，antisense primer：5TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA3’，扩增产物长度为452bp。引物均委托上海生工生物工程公司合成。(3)扩增条件：50逆转录30min，5预变性15min，循环35次(9430s，501min，721min)，再72充分延伸10min。取5μL PCR产物加1μL 6×上样缓冲液混匀（含荧光燃料GreenI），1.8%琼脂糖凝胶在100V恒压电泳约40min，紫外透射仪观察结果
