ABA增强车前草细胞悬浮培养中衍生的体细胞胚的再生

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1、本人翻译 谢绝转载ABA增强车前草细胞悬浮培养中衍生的体细胞胚的再生摘要：从大蕉(芭蕉属)cv. Spambia (genome AAB)增生嫩枝的分生组织中诱导产生的 奶油脆性愈伤组织，然后在改良的半固体MS培养基上培养，并加入4.5 uM的2,4-D 和1.0 u M的玉米素。大约25%的茎尖外植体发育成分生组织，大约98%的分生组织 发育成胚性愈伤组织。当这些愈伤组织转移到加入4.5uM的2,4-D禾和 1.0uM的玉米 素的MS液体培养基上时，可获得小密度聚集的细胞。在转移到上述MS液体培养基 中后，这些细胞聚集物会发育成体细胞胚胎。在含有2.5 uM脱落酸的培养基培养的 体细胞胚胎，

2、成熟度要比缺乏ABA的培养基(无论该培养基是否含有其他类型的植物 激素)中的体细胞胚胎高2.6倍。再转移到含有1.25uM的6-BA的MS培养基中，8 0%的已萌发的胚胎课发育成小苗。关键词：香蕉、大蕉、芭蕉属、胚性愈伤组织、体细胞胚胎发生、细胞悬液、脱落酸缩写：BA6-苄基腺嘌呤2,4-D2,4-二氯苯氧乙酸ABA脱落酸IAA生长素MSMS培养基TDZ噻二唑苯基脲引言香蕉和大蕉是营养丰富种植广泛的作物，年产量约1.04亿吨( FAO 2004)。由于 其不育性和多倍体，通过常规繁殖提高它们的抗病、抗虫性的空间是有限的(Sagi et al. 1997)。因此，可以使用生物工程技术克服这些问题

3、，提高这种作物的抗逆性。香蕉胚 性细胞的悬浮培养(ECSs )已经成功的从下列组织中诱导得到：增生的分生组织 (Dheda et al. 1991; Schoofs 1997;Schoofs et al.未成熟的雄性和雌性花 (Escala nt et al. 1994; Grapi n et al. 1996, 1998; Jalil et al.2003),未成熟的合子胚(Cronauer-Mitra and Krikorian 1988; Escalant and Teisson 1999; Marroquin et al. 1993),球茎组织和叶基(Novak et al.1989)

4、細胞原生质体(Assani et al. 2001)。然而， 这些胚胎反应差，在东非高原(Escalant et al. 1994; Panis et al. 1993)的香蕉再生能力 仍然较低。目前为止，只有少数关于大蕉体细胞胚胎发生的报道。胚性悬浮培养已经 从三倍体香蕉的根茎中开发出来，有Cardaba (ABB基因组)，SH-3362 (AA基因组) and Bocadillo (AA基因组)(Novak et al. 1989)。对东非高原上的香蕉，用与雄性花蕾 隔离的幼花作为外植体来诱导产生胚胎进行悬浮培养(Escala nt et al. 1994)。体细胞胚 胎也可以从法国Som

5、bre( AAB基因组)的雄性幼花和假角大蕉(AAB基因组)的雌 花中诱导(Grapin et al. 1996, 2000)。现在只有一个关于用茎尖分生组织做体细胞胚悬 浮培养的报道，该报道研究了大蕉、ObinolEwa和Orishele (Strosse et al. 2006)。用 茎尖做体细胞胚培养，不受季节变化的影响也与雌雄花无关，所以很适合大规模的大 蕉微体繁殖(Strosse et al. 2004)。在此研究中，建立了一个使用大蕉增生性嫩枝的茎 尖进行悬浮再生培养的有效系统，并研究了 ABA对体细胞胚成熟的影响。材料和方法植物材料用于体外培养的大蕉(基因组集团AAB)(EC 4

6、31405)茎材料是从印度新德里国家 植物基因资源局(NBPGR)的体外基因库得到的。所用的MS培养基中加入10uM BA , 1uMIAA , 3%的蔗糖，并用2.0g/L的琼脂凝固。在28弋下培养，并用白炽灯补充 pmolm_2 s_i16h的光照。多样分生组织培养将植物顶端分生组织置于25mL的MS基础培养基上培养，培养基用150mL的 培养皿盛装(一个培养皿中一个外植体)，并加入BA ( 22.2、44.4或90uM ), IAA (1uM )和56.8mM的抗坏血酸，用2.0g/L的琼脂凝固，置于黑暗处培养。每四周 就用含有同样成分的新鲜培养基按上述方法作再次培养，培养812个月，直

7、到嫩枝 转变为分生芽簇，成为所谓的scalp(Dhedaetal.1991)形状。这些作为诱导体细胞 胚发生的外植体。胚性愈伤组织的诱导切下分生组织簇的最上部分用来诱导产生胚性愈伤组织(EC )。把大小不等的表 皮转移到诱导胚的ZZss培养基上，包括改良的MS培养基(含相当于MS培养基一 半的元素和铁，0.4mgL-i的抗坏血酸，10mg L-i的ABA , 4.52uM的2,4-D , 1uM 玉米素，且不含肌醇)。已经研究了不同浓度的2,4-D ( 1.13,2.26,3.39,4.52和 9.05uM )和玉米素(1或2uM )对胚性愈伤组织的联合影响。对每个处理，使用80 个外植体，每

8、个实验重复三次。在黑暗条件下，在同种培养基上，对愈伤组织做3-4 次的继代培养，每次周期为15天。记录胚性愈伤组织产生的scalps数量。启动和维持胚性细胞的悬浮培养将胚性愈伤组织转移到装有20mLZZL培养基（与ZZss相同但不含琼脂）的 150mL的锥形瓶中，在摇床上以90转的速度震荡。取出一小等分的悬浮培养液，置 于玻片上，用光学显微镜（尼康C-FID,日本）观察细胞聚集方式和程度。一星期后， 用500uM孔径的消毒金属筛（塞提，印度）过滤悬浮培养液，滤液转移到50mL的 无菌刻度试管中，静置10min。用移液器吸取约10mL的上清液，加入到新鲜培养基 中，保持2.5-3%的稳定的细胞量

9、（SCV ）。然后转移到100mL的无菌锥形瓶中，在 黑暗处置于90转得摇床上震荡。这个过程每周一次为期一月，然后两周一次直到获得 胚性细胞群。从胚性愈伤组织中诱导产生体细胞胚取出200uL的聚集细胞放在双层滤纸上，保存在90mm的装有25mmZZss培养 基的有盖培养皿中。培养一等份的聚集细胞所多余的液体培养用滤纸吸取10min，然 后移去底层滤纸，使细胞落到上层滤纸上直接接触培养基。持续培养4 周，然后转移 到新鲜的ZZss培养基上培养2-3个月。体细胞胚的成熟在解剖显微镜下观察到鱼雷形胚后，单个的转移到RD1培养基（加入了半量主要 盐和铁，全量微量盐、维生素和100mg/L肌醇的半固体M

10、S培养基）上，补充不同 浓度的ABA（ 0,1,1.25,5,10uM ）培养3周使其成熟。大约每个培养皿中100个体细 胞胚。在含不同细胞分裂素的培养基中的体细胞胚的萌发和小苗强化对半固体MS培养基中BA、玉米素和噻苯隆的不同浓度（1-10uM ）对体细胞胚 萌发的影响进行评估。将已萌发的体细胞胚转移到加有&89uM的半固体MS培养基 上，4-6周后，将再生根转移到含有1%蔗糖的MS基础培养基上生根。将由较发达的 根和芽的小苗置于含有 agropeat（ PrakrutiAgrotech,Bangalore,India ）的小盆中 炼苗，以 Hoagland 方法 （Hoagland and

11、 Arnon 1950）灌溉。将小盆转移到温室中， 在252弋，16h的光照，70%的相对湿度下培养2个月。然后将小苗移栽倒苗圃里。结论与讨论表皮的形成使分生组织增生的最佳BA浓度是44.4uM （表1）,超过69%的茎尖外植体都 发育成Scalps（结构类似花椰菊。外植体培养在加入44.4uMBA和luMIAA的MS 培养基上，在两个月的培养中从外植体底部观察致密的细胞团如图1a,b。在继代培养 的8-12个月得到Scalps（图1c,d）。上文提到的Dhedaetal.（1991）的报告指出， 10uM的BA是诱导大蕉plantain cv. Bluggoe（ AAB）形成scalps所必

12、需的。同时， Strosseetal.（2003）的报告指出，芭蕉类作物Musaspp.（AAA）的scalps的形成需 要7-9个月的继代培养，并且，培养须在加有高浓度BA（ 100uM ）的培养基上进行。 这些结果表明，不同基因型的芭蕉的scalp的形成须在不同的植物调节下诱导。表1在含有1uMIAA的情况下，不同BA浓度对大蕉分生组织增殖的影响BA (pM)Huniber ofexplainsMean nmnber 土 SD of scalps fonned22.2353 土 1.52 b44.43625 土 3卫Cl a900405 土 2.00 b图1不同发育阶段的大蕉scalp。M

13、S培养基中含有44.4uMBA和luMIAA ,白色线 为1mm。a,b分别为培养1个月和2个月后。C,8个月后分生簇数量增多。d培养11 个月后，得到大量理想的分生簇。胚性愈伤组织的诱导在scalps的培养过程中，不同组合的2,4-D和玉米素，2-3天内突起的直径为3- 6mm,5-6周后，得到奶油颜色的胚性愈伤组织（图2，a ）。3-4个周后得到大量体 细胞胚，转移到新鲜的ZZss培养基上做每月一次的继代培养（图2, b）o反之，非 胚性愈伤组织小结是淡黄色，可以在培养的6周检测到（图2,c,d ）。愈合胚的形成频 率0-98%不等，主要由培养基决定（表2 ）。小于0.3mm的外植体都坏死

14、，同时， 大于0.7mm的也没发育成胚性愈伤组织。在不含IAA的培养基中，scalp形成的频率 很低，只有10%，并伴有黄色结节结构的形成。在含低浓度2,4-D（ 1.130uM ）培养 基上，所有scalps的外植体都没萌发产生愈合组织。在所有不同的2,4-D和玉米素组 合测试中，在4.52uM的2,4-D和1uM的玉米素的组合中得到最高的胚性愈伤组织 量（ 98%）。这些结果与 Dheda et al. （1991）和 Strosse et al. （2006）的研究一致这些频率高于早先报道的一些大蕉和食用香蕉3%的频率(Schoofsetal.1998;Cote etal.1996) ，

15、也高于其他一些芭蕉属基因型的 3-22%(Strosseetal.2004) 。Escalantetal.(1994)也曾报道过三种芭蕉基因型AAA , AAB和ABB的，有雄花诱 导产生的愈合组织胚的形成频率，为 0-7%。图 2 从大蕉 plantaincv.Spambia. 的 scalps 中诱导产生愈伤组织标尺为2mma,ZZss培养基上5周时继代培养的胚性愈伤组织；b,在a阶段的得到 的愈伤组织在3-4次周期一月的继代培养的胚性愈合组织；c,d，在ZZss培养基上做 5-6周继代培养后在scalp上层得到的愈伤组织结表 2 植物生长调节剂组合对大蕉 plantaincv.Spambia 诱导体细胞胚的影响XkdiA codePlant grCMih tguhioisNo. of eiphils1% hphots kki dopingEC佃删二5DFUD(pM)Zeatin QiMiZ11史側0.0 =.0,0fnwL24351)j6S 8.时 czs3.393L2467.46 二 S.23 bZ44.524L25598J06 上 0.6 a91期24J09 二 2.1 eZfi史22400.0 =.0.0f712.26224041j64 士 10.92 cdZii3.39322403&22 = 2,4