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1、一种普鲁兰酶嵌合体及其在毕赤酵母中的高效表达普鲁兰酶能够水解支链淀粉中的a-1,6糖甘键，是医用葡萄糖生产中糖化阶段不可缺少的原料。本文利用DNAShuffling技术获得一种普鲁兰酶嵌合体WXP03,E巴斯德毕赤酵母GS115细胞内获得高效表达。通过构建以相同启动子共表达淀粉酶基因的重组菌,通过化学诱变和对淀粉酶高产菌株的筛选,间接筛选到普鲁兰酶产量提高的菌株。主要研究内容如下:(1)按照巴斯德毕赤酵母密码子偏好性优化来源于Bacillusderamificans和Bacillusnaganoensis的普鲁兰酶编码基因BdP8和BnP2在巴斯德毕赤酵母GS115M胞内实现BdP8和BnP2
2、的高效表达。对重组酶BdP8和BnP2的研究发现：BdP8有较高的耐酸性但比酶活很低，而BnP2有较高的比酶活但耐酸性不理想。(2)利用DNAShuffling技术对BdP8和BnP2基因进行随机重组，通过平板筛选,获得一株有较高比酶活和较好耐酸性的普鲁兰酶嵌合体WXP03f建高表达WXP03勺重组酵母PichiapastorisGS115/PIC9K-WXP03M8。重组酶WXP03最适温度为55C,最适pH为4.5,在pH4.0、55c条件下酶活半衰期为12h,基本满足糖化工艺的要求。重组酶WXP03勺动力学常数Km为2.5mgmL-1,Vmax为500molmin-1L-1,最适条件下的
3、比酶活为213.3U-mg-1。(3)密码子优化来源于B.deramificans的普鲁兰酶基因突变体BdP4,并在巴斯德毕赤酵母GS115中获得表达，筛选得到高表达菌株P.pastorisGS115/PIC9K-BdP4WB54重组酶BdP4最适温度为50C,最适pH为4.0,动力学常数Km为1.4mgmL-1,Vmax为330mol-min-1L-1,纯酶比酶活为281.4U-mg-1。在5L发酵罐上对重组菌WB54s行发酵条件优化，获得最佳发酵条件为：pH4.5,在OD60财360时开始诱导,甲醇添加量为9.9mLh-1L-1,在最佳发酵条件下，重组菌WB5*鲁兰酶表达量为2031.0U
4、-mL-1。(4)以重组菌M8为出发菌株，诱变筛选获得尿喀呢营养缺陷型菌株E107;构建在AOX0动子;f5制下，分泌表达淀粉酶基因SfA的重组载体pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP转化菌株E107，得到重组菌P.pastorisGS115/PIC9K-WXP0H11。对菌株H11进行化学诱变，通过对淀粉酶高产菌株的平板初筛和摇瓶复筛,筛选到淀粉酶活力提高幅度在10%以上的突变株有17株,淀粉酶高产菌株中普鲁兰酶酶活提高幅度在5%以上的菌株有7株,占总数的41.2%,淀粉酶表达水平提高与普鲁兰酶表达水平提高表现出一定的相关性。其中突变株J359普鲁兰酶提高幅度达15%。删除菌株J359的淀粉酶表达框，再回补PpURA基因，获得普鲁兰酶高产菌株P.pastorisGS115/PIC9K-WXP03WBB359摇瓶条件下重组菌WBB35普鲁兰酶表达水平比出发菌M8提高15.6%。在优化的5L发酵罐发酵条件下，重组菌WBB359普鲁兰酶表达量为2101.3U-mL-1。
