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1、第一章 基因工程概述第一节 基因操作与基因工程基因操作( gene manipulation )：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和 转移等操作的总称。基因工程( gene engineering )：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其它DNA元件进行切割，与适当的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞，并使外源基因进行复制 和表达，定向改造受体生物性状或获得表达产物。基因操作与基因工程的关系：基因操作的核心是基因重组( gene recombination )技术， 基因工程是基因操作、基因重组的核心内容和主要目的。基因工程的遗传学效果： 受体生物发生遗传信息或遗传性状的
2、变化并能稳定遗传给下一代。 第二节 基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础 遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子。 基因( gene)是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传学功能，可以是连续的， 也可以是不连续的， 可以是 DNA也可以是 RNA，可以存在于染色体上， 也可存在于染色体之 外(如质粒、噬菌体等) 。基因工程的理论基础： . 明确了遗传信息的携带者基因的载体是 DNA，明确了遗传的物质基础。. DNA 分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以阐明，解决了基因的自我复制和传递问 题。 . 中心法则、操纵子学说的提出以
3、及遗传密码子的破译，解决了遗传信息的流向和表达 问题。(4). 遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因工程原理和技术在生物界普遍适用， 尤 其是可以实现跨越任何物种界限的遗传成分转移 自此，从理论上讲，基因工程已有可能成为现实 基因工程的技术基础： . DNA体外切割和连接技术（限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现与应用，标志着 DNA重组时代的开始） 。 . 克隆载体的发展与应用。 . 大肠杆菌转化体系的建立。 . 琼脂糖电泳技术的应用。. DNA 测序技术的应用。 . 核酸杂交技术的应用。从技术上为基因工程的诞生奠定了基础。 四、基因工程的内容1、基因操作原理：（ 1） DNA和 RNA
4、的操作。（ 2）基因克隆与功能研究。（ 3）基因组学与生物信息学的应用。2、基因工程的应用：（ 1）生物反应器（ bioreactor ）：大规模生产生物活性分子如生长激素、胰岛素等。（ 2）遗传改良（ genetic improvement ）、分子育种（ molecular breeding ）、设计构建新 物种。（ 3）基因治疗（ gene therapy ）：人体转基因或基因组编辑。第三节 基因的结构基因操作的理论基础 一、基因的结构组成对基因操作的影响1、基因及其产物的共线性：一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列一一对应。N 个氨基酸 =3N 个编码碱基。2、基因及其产物的非共线
5、性。间断基因内含子( intron )是指真核基因在 RNA加工过程中从原初转录本中剪去而不进入成熟 RNA结构、不具有氨基酸编码能力的一段序列。外显子( exon)：是真核基因转录本中剪去内含子后所保留的RNA片段，它们拼接并进行适当修饰后成为成熟 RNA并执行相应功能。3、基因的重叠性与可变性：基因的重叠性：单个 DNA序列可编码一个以上的蛋白质，它们在结构上可以具有序列重复 性，也可以是相互完全不同的全新蛋白质。原因：可变性转录起始位点、可变性起始位密码子、可变性编码终止位点、可变性剪接。 开放读码框( open reading frame ，ORF)：成熟 mRNA中从起始密码子 AT
6、G至终止密码子(TAA、 TAG或 TGA之一)之间形成的一个连续的氨基酸编码区间。以起始密码子的第 1个碱基作为 +1，其 5方向的第 1个碱基为 -1。4、启动子和终止子启动子( promoter )：基因转录过程中控制起始的部位，通常是位于转录起始位点5上游的一段 DNA区间，其上有许多顺式元件。转录起始位点( transcription start site )：起始转录的第一个碱基，也是掺入到 RNA中 的第 1个碱基。在转录研究中记为 +1，其 5方向的第 1个碱基(已属于启动子而非转录区) 为 -1 。侧翼序列( flanking sequence )：一条核酸单链上位于某一特定
7、位置的 5或 3方向的序 列。上游( upstream )：一条核酸单链上位于某一碱基的 5方向。下游( downstream)：一条核酸单链上位于某一碱基的 3方向。终止子( terminator )：位于基因的 3部位、终止基因转录过程的一段 DNA区间。有依赖 不依赖因子两种。段区间，是核糖体结合并起始翻译过程的位点。原核和真核的RBS显著不同。转录单位( transcription unit) / 转录本( transcript )：从转录起始位点直至转录的最后一个碱基之间被转录的 RNA序列，可以包含一或多个蛋白编码框。亚克隆( subcloning )：1、将大片段克隆子的 DNA
8、重新打断成小片段， 然后分别克隆到新的载体中， 供进一步研究。 初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的 DNA片段，在诸如表达序 列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段 DNA找出来，这个 过程叫“亚克隆” 。2、通指将 DNA片段从一个载体穿梭克隆到另一个载体的过程。亚克隆技术：泛指实验室中以 DNA在大肠杆菌中经典克隆操作为核心的基本技术体系。第二章 分子克隆工具酶第一节 限制性内切酶一、限制与修饰1、限制与修饰现象：限 制 (restriction) ： 指 一 定 类 型 的 细 菌 可 以 通 过 限 制 性 内 切 酶 ( restrict
9、ion ednonuclease )的作用，破坏入侵的噬菌体 DNA，导致噬菌体的寄主范围受到限制。限制作用实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。修饰 (modification) ：指寄主本身的 DNA，由于在合成后通过甲基化酶( methylase )的作 用得以甲基化，使 DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。 甲基化作用：最主要的碱基修饰，使腺嘌呤 A 成为 N6-甲基腺嘌呤，胞嘧啶成为 5- 甲基 胞嘧啶。限制酶是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA
10、双链结构的核酸水解酶。限制酶存在于细菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中没有限制酶。3. 限制性核酸内切酶的种类 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、 型三大类。型限制酶用途大， 多为同源二聚体， 其中切口酶只在单链上产生切口， s 型识别序列和 切割位置特殊。二、限制酶识别的序列1、限制酶识别序列的长度 (n) ：一般为 4-8 个碱基对，最常见为 6bp。识别位点出现频率： 4n2、限制酶识别序列的结构：多数为回文结构(palindrome )即镜像对称结构。一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并的， 还有一些酶识别序列呈间断对称，即回文对称序列之
11、间可以间隔一定长度的任意碱基。3、限制酶的切割位置：多数在识别序列内部，也有在外部、两端、两侧或单侧的。三、限制酶的功能和产生的末端类型 限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的 DNA片段 5端为 P，3端为 OH，识别序列一般为 46 个碱基对， 通常是反 向重复顺序，具有 180的旋转对称性，即回文结构。限制性核酸内切酶切割双链 DNA产生 3 种不同的末端类型。1、对称型突出末端：回文结构决定对称，分为5突出和 3突出的粘性末端( cohesive/sticky end)两种。2、平末端 (blunt end)：任何平末端酶的酶切产物可
12、以互连， 但连接效率比粘性末端低 100 倍左右。3、非对称的突出末端：因为识别序列是非回文的、简并的或存在间隔序列，故产生的粘性 末端也为非对称的。即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向性4、同裂酶( isoschizomer )：不同的酶识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，又 分为同序同切酶、同序异切酶、同功多位酶和其它类型。例： Sma (CCC GGG和) Xma (C CCGGG)5、同尾酶( isocaudarner )：不同限制酶识别序可以相同，也可以不同，但它们产生的末 端是一样的，末端间可以相互连接。同尾酶在基因工程尤其是载体构建中有较大用途。例：Xho(CTCGAG与
13、) Sal (G TCGAC、)BamHI(G GATCC和) Bgl (A GATCT)6、归位内切酶( homing endonuclease )：一些线粒体、叶绿体、核 DNA和 T 偶数噬菌体的 内含子编码内切酶 (称为 I-prefix )或内含肽( intein )具有内切酶活性 (称为 PI-prefix )。 它们识别序列很长，核心识别序列一般为10-12bp ，识别位点极少。四、DNA末端长度对限制酶切割效率的影响 限制性核酸内切酶识别和切割靶序列时需要识别序列两侧具有一定长度的DNA，否则会降低切割效率。对侧翼长度敏感性较低的酶有 EcoR等，只要一个侧翼碱基即保证 90%
14、的效率。 对侧翼长度敏感性高的酶有 Acc、 Hind 、 Pst 等，侧翼 3 个碱基以上也未必理想。 设计引物、接头等时要考虑适当长度的保护碱基，载体构建时多克隆位点中的相临位置的 酶的切割序列的选择也很重要。限制酶的活性单位( unit )：1 个单位的酶是指在建议的缓冲液及温度下，在20l 反应液中反应 1h，使 1g DNA(多用)完全消化所需要的酶的量。五、位点偏爱 某些限制酶对同一底物中的不同位置的识别位点的切割效率不同，表现出偏爱性，这种现 象称作位点偏爱。噬菌体 DNA为 48502bp，两某些噬菌体 DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性不同 端为 12bp 粘性末端。
15、EcoR酶切割噬菌体中的 5 个位点时并不是随机的， 靠近右端的位 点比分子中间的位点切割快 10 倍；EcoR对腺病毒 2DNA不同位置切点的切割速率也不同。 由于位点偏爱性， DNA用 Hind 消化而制备的 Hind DNA marker 中 4.3kb 条带甚至 比 2.0kb 条带还弱。原因：切割时需要同时与 2 个识别位点作用(如 Nar等)，或识别和切割时要求在 DNA上 有 2 个明显不同的结合位点，其中 1 个是另 1 个的被切割时起激活作用的变构位点。 应对办法：超量用酶、延长切割时间。七、限制酶的星活性 (star activity) 在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列不同但相似的序列， 降低酶切反应的特异性，这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。产生原因： 反应体系中甘油的浓度大于 5%。 酶用量过大，大于 100 U/ g DNA。 低离子强度，小于 25 mmol/L 。 高 pH，大于 8.0 。 含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、 Zn2+等非 Mg2+的二价离子的存在。 易发生星活性的内切酶有： E
