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1、分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号： 班级： 时间：一、实验目的：1. 学习并掌握凝胶电泳进行 DNA的分离纯化的实验原理。2. 学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。3. 学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。4. 掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。5. 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。二、实验原理：1. 质粒DNA的提取一一碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA勺方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸 法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和 Wizard法等。其中， 碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒 DNA勺提取。该方法操作简 单，易于
2、操作，一般实验室均可进行。提取质粒 DNA纯度高，可直接用于酶 切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质 量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质 粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提 取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含 有RNA但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。碱变性法提取质粒DNA-般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质 粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒 DNA。在细菌细胞中，染色体 DNA以双螺旋结构存在，质粒 DNA以共价闭合环 状形式
3、存在。细胞破碎后，染色体 DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变 性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色 体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用 pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐 溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超 螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体 DNA不能复性，而是与不稳定的大分子 RNA蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉 淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒 DNA分离。溶于上清的质粒 DNA可 用无水乙醇和盐溶液，减
4、少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形 成沉淀。由于DNA与 RNA生质类似，乙醇沉淀DNA勺同时，也伴随着RNA沉 淀，可利用RNase A将 RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶 性蛋白，可通过酚 / 氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒 DNA。2. 凝胶电泳进行DNA分离纯化：电泳(electrophoresis) 是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极 方向移动的现象。各种生物大分子在一定 pH 条件下，可以解离成带电荷的 离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛 效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的
5、速度 可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可 以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化 DNA 片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭 (ethidium bromide , EB) 或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至 20pg的双链DNA在紫外激发 下也能直接检测到。需要的话，这些分离的 DNA条带可以从凝胶中回收，用 于各种各样目的的实验。分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖 (agarose) 和聚丙烯酰胺凝胶。 这两种凝
6、胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位 进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸(5 500bp)的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差 1bp 或质量上相差 0.1% 的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 DNA序列分析 的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA1样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状 多聚物，由B -D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质 量为104-105。琼脂糖加热至90C左右，即可溶化形成清亮、透明的液体， 浇在模版上冷却后形成凝胶
7、，其凝固点为40-45 C。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大(50 至百万 bp) ，小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶 内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA勺相对分子质量，分离经限制酶水解的 DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带 有负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取 决于6个因素：样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳 所用电场、缓冲液和温度。三、主要仪器和材料试剂：1. 仪器和材料
8、：恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1.5mL离心管， 50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽， 电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯， Eppendorf 管等。 菌体：E.coli DH5a受体菌，具有Amp标记的质粒pUC192. 实验试剂：LB培养基，抗生素(氨苄青霉素)，溶液I,溶液U,溶液川，RNase A 母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇(PCI) 混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液(10X)，上样缓冲液(6X)， 琼脂糖，溴化乙锭(EB),DNA相对分子质量标准物 DNAMarker入/Hi
9、nd IH， 5mol/L pH 5.2 的醋酸钠。四、实验步骤：1. 菌体培养：(1) 配制 40mL 液体 LB 培养基(加入 5%葡萄糖)、 100mL 固体 LB培养基、并准备足量的移液管、200卩l微量移液器头、1000卩l微量移液器头、50mL离心管、1.5mL离心管，灭菌备用。(2) 向液体LB培养基移取32卩l氨苄青霉素，混合均匀。(3) 将提前活化的E.coli DH5a受体菌，接种于液体LB培养基中。将锥形瓶放入恒温震荡培养箱中，37C, 200r/min培养12-16h2. 质粒DNA勺提取：(1) 称量50mL离心管重量 W1取30mL菌液于已称重的 50mL离心 管中
10、，配平后 6000r/min离心5min。(2) 弃上清，向离心管中加入5mL溶液I,涡旋振荡， 6000r/min 离心5min。(3) 弃上清并称重 W，求 W=WW。(4) 按照1.0mL/100mg菌体的量加入溶液I,充分涡旋振荡，冰浴5min，再按照2.0mL/100mg菌体的量加入溶液U,温和颠倒混匀，冰浴2min，然后再按照1.5mL/100mg菌体的量加入溶液川，温和颠倒混匀，冰浴10min，平衡后12000r/min离心15min。(5) 取上清至新50mL离心管内，记录体积，加入两倍体积的冰乙醇，混匀后在-20 C环境下保存 30min。取出后12000r/min离 心15
11、min，弃上清，加入5mL703乙醇，12000r/min 离心5min， 弃上清，加入 5mL70汇醇，12000r/min 离心5min，弃上清， 37 C放置 5-10min。(6) 取出离心管，加入ImLTE溶液得到粗提物，加入RNase A 液,使溶液浓度为 150卩g/mL , 37 C保存60-120min。3. 质粒DNA勺纯化：(1) 取500卩l粗提物于1.5mL离心管中，加入等体积的Tris饱和酚， 混匀，12000r/min 离心 10min。(2) 转移上清(体积V)至新管，加入等V1的酚：氯仿：异戊醇溶液， 混匀，12000r/min 离心 5min。(3) 转移上
12、清(体积V0至新管，加入等 V2的氯仿：异戊醇溶液，混 匀，12000r/min 离心 5min。1(4) 转移上清(体积V3)至新管，加入10V3的3MNaAc溶液(pH5.2), 再加入2V4 (屯+診)的冰乙醇，混匀，-20 C保存30-60min ,取出后 12000r/min 离心 15min。(5) 弃上清，加入 500卩l 70%乙醇，10000r/min 离心2min,再加入 500 卩 l 70% 乙醇，10000r/min 离心 2min, 37C保存 5-10min。(6) 取出离心管，向一只离心管中加入 25卩lTE溶液，溶解沉淀后， 转移入另一只离心管中，再取25卩l
13、 TE溶液加入第一只离心管中， 溶解后再移入另一只离心管中，得到 50卩l纯化质粒DNA4. DNA纯度检测：(1) 取40mLTA(1X)于300mL锥形瓶中，加入0.4g琼脂糖，放入微 波炉内使其熔化，60C时倒入准备好的制胶槽中。(2) 取5.0卩l纯化DNA加入1.0卩l上样缓冲液，混合，进行点样。(3) 点样完毕后，100V, 200mA条件下电泳 30min。(4) 电泳完毕后，进行EB染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结 果。五、实验结果：凝胶成像仪拍照如下:图1 DNA纯度检测凝胶成像结果 (1号泳道：DNA marker入/Hind川；2号泳道：超螺旋 状态的pUC19质粒DN
14、A 3号泳道：线性的 pUC19质粒DNA 4号泳道：空泳道；5至9泳 道：7至11组pUC19质粒DNA羊品；10号泳道：入DNA本组点样在第9泳道，照片显示各种杂质去除得较为彻底，得到了较高 纯度的超螺旋状态的pUC19质粒DNA六、讨论：1. 为获得高纯度的质粒DNA必须彻底去除杂蛋白、染色体 DNA和RNA在整个质粒提取过程中出去染色体 DNA的关键步骤是加入溶液U、溶液川 的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。加入溶液I时，可剧 烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体 不会断裂；加入溶液U时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液 川时，会立即出现白色沉
15、淀。加入溶液U和溶液川后，应缓慢上下颠倒 离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNAS纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法， 既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。2. 酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到 酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。3. 为最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再将离心管放入离心机稍 作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部， 再用移液器移除液体。4. 注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也 不要快速按出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。5. 本次实验中，原应灭菌之前加入培养基内的葡萄糖由于操作疏忽而忘记 加入，随后按照老师指示配制100mL10%勺葡萄糖溶液一起灭菌，待灭菌 后再将葡萄糖溶液加入培养基中。6. 培养菌体所用勺 14 个锥形瓶有 2个锥形瓶中没有菌体生长迹象， 另外有2 个锥形瓶内菌体生长较少。 原因可能是接种时操作失误， 例如可能是接 种环挑取菌种后离酒精灯火焰太近或者挑取菌种前没有充分冷却，也有 可能是接种时接入勺菌量过少等。7. 在纯化DNA加入冰乙醇的步骤中，2只离心管在加入的DNA羊品量相同的情况下，出现了从-20 C环境下取
