分子检验检测技术

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1、分子检验检测技术课程讲义一、分子诊断又称DNA诊断或基因诊断，是通过从生物体（比如疾病患者等）内提取样本用基因检测方法来判断该生物体是否有基因异常或携带有其它不应该属于该生物体的生物成份。 （检测物）病原1 DNA 加热 退火（降温） 是否杂交（待检物）病原2 DNA 加热 退火（降温）注意：用于分子检测的器皿都需要消毒、灭菌所用水必须是双蒸水、去离子水二、分子检验检测的意义 随着社会经济的发展，国际国内贸易的日趋频繁，有害生物的扩散加速，动植物检疫工作越来越受到重视，由于检疫性有害生物的扩散造成的各类问题备受关注。 实现对检疫性有害生物的快速检测是当前社会经济发展的迫切需求。三、分子检验检测

2、与传统检验检测方法的异同传统检验检疫方法：耗时，专业要求高等等，主要是症状上判断：同症状，多病原，疑难多，问题也多，耗时、耗材、耗力，对结果的准确性影响很大，且对专家的要求很高。 分子检验检测方法：快速，准确等等，直接从遗传物质入手，根据核酸序列来检测，既准确又快速。DNA序列的独特性、专一性的检测标记进行鉴定。四、分子探针，特异性其特点：三个相连核苷酸组成一个密码子，编码一个氨基酸，共有64个密码子。密码子之间无核苷酸间隔。一种氨基酸可有多种密码子。所有生物使用同一套密码子。分子生物学的基础一、几个简单的问题1.分子生物学主要研究什么？ 分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，

3、它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构、组成和功能，以及它们在遗传信息和细胞信息传递中的作用等为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其他学科广泛交叉和渗透的前沿领域；它包括：a、研究核酸结构及其功能的核酸分子生物学；b、研究蛋白质结构与功能的蛋白质分子生物学；c、研究细胞信息传递与细胞信号传导的细胞分子生物学等。 2.核酸包括什么？3.核苷酸是怎么连接的？4.什么是一级结构？ 5.二级结构是什么？6.三级结构呢？7.那么酶切是切什么？几级结构？8.RNA有几种？各有什么功能和特性？ 二、核酸的理化性质 1粘度 2紫外吸收 3沉降系数 4溶解性 5变性和复性三、思考题 请简述生物体、细胞、染色

4、体、蛋白质、核酸、基因等相互间的关系，并阐述分子检验检测的目标对象。三、分子诊断技术概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对病害作出诊断的方法。特点：针对性强、特异性高、灵敏度高、适用性强、诊断范围四、分子诊断的常用技术方法 核酸分子杂交技术1.限制性内切酶酶谱分析法 2.DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析3.等位基因特异寡核苷酸探针（allele specific oligonucleotide，ASO）杂交法聚合酶链反应（PCR）基因测序基因芯片 动

5、植物检疫的理想目标是：防止所有的检疫性有害生物（物质），人为跨境（国家或地区）传播，并及时地发现、限制或铲除外来的检疫性有害生物。 动植物病原物检验检疫技术是动植物检疫工作的重要组成部分，在动植物、动植物产品及其他检疫物的装载容器、包装物，以及来自动植物疫区的运输工具中是否有有害生物，或有害生物的种类与数量有多少，只有通过检测才能知道。动植物检验检疫的目的就是要发现、检查和鉴定有害生物，以作为出证放行或作进一步检疫处理的依据。 检测检验是判断一个样品内是否存在特定目标病原物，而病害诊断是病害发生原因和性质的鉴定。 检测检验技术要求快速、准确、灵敏、安全、高通量、简便、易于标准化和推广应用。 有

6、害生物的传统检测鉴定，主要是从症状、形态鉴定、接种鉴别寄主、病原物培养性状等方面来观察有害生物所表现的表型和性状来判断，受环境因素，人为因素等多种因素的影响，往往影响对结果的准确判断。 此外，对于病害，许多传统的诊断程序一般都涉及到两个过程：第一，先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理生化特性；第二，确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌还是其他的物质。这种诊断方法成本高、速度慢、效率低。如果病原体生长特别慢或者根本无法通过人工培养的方法获得，例如有些衣原体、植原体就不能培养或很难人工培养，那么这种传统的诊断程序就很难有结果。 分子生物学研究表明，所有生命类型和不同物种差异的根源都是由

7、遗传物质（DNA或RNA）决定的，而遗传信息又是核酸上的核苷酸序列所决定的。因此最准确的检测鉴定方法，就是测定一些基于核酸序列的分子生物学检测技术。 分子检测技术主要是指应用分子生物学的方法来对有害生物进行诊断检测鉴定。从理论上讲，任何一个决定特定生物学特性的DNA序列都应该是独特的，都可以用作专一性的检测标记，这就是分子诊断检测鉴定的理论基础。 不论是传统的常规检测，还是现代的分子技术，一种有效的检测方法都应该具备以下3个条件：专一性（specificity）强，这指的是检测只对目标分子或只对某一种有害生物分子产生阳性反应；灵敏度（sensitivity）高，是指即使只有微量的目标分子，或是

8、在有很多干扰存在的情况下，也能够很灵敏地检测出所寻找的那种有害生物的分子；操作简单（simplicity），主要是指在做大规模检测时，要求能够操作方便、简单、高效、廉价。分类、鉴定、命名、诊断分类（classification）分类的任务是解决从个别到一般或从具体到抽象的问题，亦即通过收集大量有关个体描述的资料，经过科学的归纳，整理成一个科学的分类系统。理想的分类系统应该是反映生物进化规律的自然分类系统。鉴定（identification） 鉴定的任务与分类恰恰相反，它是从一般到特殊或从抽象到具体的过程，亦即通过详细的观察和描述一个未知名称纯种生物的各种性状特征，然后查找现成的分类系统，以达到

9、知类辨名的目的。将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。命名（nomenclature）命名的任务是为一个新发现的生物种确定一个新学名。亦即当你详细观察和描述一个未知菌种后，经过认真查找现有的权威性分类手册，发现这是一个以往还未记载过的新种，这时就得按微生物的国际命名法规给以一个新的学名。诊断 （diagnosis）从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。DNA提取与测定及PCR分子生物学基础1、核酸的组成、结构与性质 核酸(nucleic acid)是体内重要的生物大分子，由于最初从细胞核分离出来，又具有酸性，故称为核酸。核酸的基本组成单位是核苷酸 。D

10、NA的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸。RNA的基本组成单位是核糖核苷酸 。嘌呤 嘧啶 碱基腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）DNA、RNA均有DNA有RNA有1 碱 基 嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)戊 糖构成RNA 构成DNA核 苷：核苷 = 碱基 + 戊糖连接方式：糖苷键嘌呤环上的N-9或嘧啶环上的N-1与糖的C-1以糖苷键相连。核苷酸核苷酸糖苷键酯键核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脱氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP RNA和DNA中常见的核苷酸碱 基RNADNA腺嘌呤腺嘌呤核苷酸（腺苷酸，AMP）腺嘌呤脱氧核苷

11、酸（脱氧腺苷酸，dAMP）鸟嘌呤鸟嘌呤核苷酸（鸟苷酸，GMP）鸟嘌呤脱氧核苷酸（脱氧鸟苷酸，dGMP）胞嘧啶胞嘧啶核苷酸（胞苷酸，CMP）胞嘧啶脱氧核苷酸（脱氧胞苷酸，dCMP）尿嘧啶尿嘧啶核苷酸（尿苷酸，UMP）胸腺嘧啶胸腺嘧啶脱氧核苷酸（脱氧胸苷酸，dTMP）游离核苷酸及其衍生物多磷酸核苷酸环化核苷酸: cAMP，cGMP2.核酸的分类及生物功能 核糖核酸（RNA）：遗传信息的载体核糖体RNA（rRNA）:约占细胞中RNA总量的80%，是细胞质中核糖体的组成成分。蛋白质合成场所，指导蛋白质合成。转运RNA（t RNA ）:约占全部RNA的15%，转运RNA是细胞中相对分子量最小的一种RNA

12、分子，以游离态存在于细胞质中。转运氨基酸。信使RNA（mRNA） : 占细胞中RNA总量的5%左右。它是以DNA为模板，经转录合成。转录遗传信息。3.核酸的一级结构 核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。 核苷酸之间以3 , 5 -磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。4.核酸的空间结构 a.DNA的双螺旋二级结构 DNA双螺旋模型的基本要点 1. 两条链反向平行，围绕同一中心轴构成右手双螺旋 。螺旋直径2nm，表面有大沟和小沟。2. 磷酸-脱氧核糖骨架位于螺旋外侧，碱基垂直于螺旋轴而伸入内侧。每圈螺旋含10个碱基对，螺距为3.4nm。3. 两条链通过碱

13、基间的氢键相连，A对T有两个氢键，C对G有三个氢键，严格按照碱基配对原则。4. 维持双螺旋稳定的因素：横向为氢键，纵向为碱基间的堆积力。b.DNA的三级结构 DNA的三级结构指在二级结构的基础上，DNA双螺旋进一步卷曲所形成的闭合环状、线状等超螺旋结构。 c.RNA的空间结构 单链RNA自行盘绕形成局部双螺旋区，在螺旋区，A与U配对，G与C配对。在3种RNA中，目前，研究最清楚的是tRNA的空间结构，它的二级结构均为三叶草形，三级结构呈倒L形。 核酸与核苷酸的主要性质及其应用 1 . 一般理化性质 核酸为多元酸，具有较强的酸性；DNA是线性高分子，粘度极大；2. 紫外吸收性质 在260nm波长

14、有最大吸收峰，是由碱基的共轭双键决定。这一特性常用作核酸的定性、定量分析。3.核酸的变性、复性与杂交 核酸的变性：在某些理化因素作用下（温度、酸碱、有机溶剂、尿素等），核酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结构松散变成单链的过程。变性产生增色效应。变性表征： 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应） 变性因素： pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度、加热 核酸的复性：变性核酸在一定条件下如温度逐步恢复到生理范围内，两条互补链重新恢复天然的双螺旋构象。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性即 “退火”。 退火温度Tm25复性影响因素: 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度复性特点：紫外吸收减少减色效应：DNA复性过程中，紫外吸收减少的现象常用的复性方法：退火 杂交：不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些不同的核苷酸单链由于存在包括：DNADNA 杂交 DNARNA 杂交 RNARNA 杂交原因：不同核酸的碱基之间可以形成碱基配对用途：是分子生物学研究与基因工程操作的常用技术