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1、细菌与真菌学实验实验一 细菌形态结构观察【目的】1、了解细菌的基本形态和特殊结构观察法2、明确细菌特殊结构在医疗实践中的意义3、细菌不染色标本的观察方法4、观察活细菌的形态及运动情况【材料】 革兰染色标本片：1、球菌：葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。2、杆菌：伤寒沙门菌、大肠埃希菌、炭疽芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌。3、螺形菌：霍乱弧菌或水弧菌。细菌特殊结构标本片：1、鞭毛:变形杆菌、 霍乱弧菌2、荚膜:肺炎链球菌、 产气荚膜杆菌3、芽孢：破伤风杆菌、 炭疽杆菌细菌动力观察材料：1、菌种：普通变形杆菌、表皮葡萄球菌。2、变形杆菌和表皮葡萄球菌812min肉汤培养物。3、其他：凹玻片、盖玻
2、片、凡士林、牙签、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸一 细菌形态结果观察1、使用油镜观察上述革兰染色标本片：认识细菌的三种基本形态。注意观察各菌的形态、大小、排列方式及染色性等特点。2、使用油镜观察细菌的特殊结构标本片：（1）荚膜：肺炎链球菌经革兰染色后，呈矛头状成双排列，菌体四周有不着色的透明圈（既荚膜）；肺炎链球菌与产气荚膜杆菌的荚膜（荚膜染色法），注意观察菌体及荚膜的颜色及两者的形态特点。（2）鞭毛：变形杆菌与霍乱弧菌的鞭毛（鞭毛染色法），注意观察菌体和鞭毛的颜色、鞭毛的长短、数目及在菌体上的位置。（3）芽胞：破伤风梭菌及炭疽杆菌芽胞（芽胞染色法），注意观察菌体、芽孢的形态、颜色及芽
3、孢在菌体中的位置。二、细菌不染色标本观察法（动力观察法）1、悬滴法图211（1）取一张洁净盖玻片，用牙签涂少许 凡士林于盖玻片的四个角处。（2）用接种环取34环普通变形杆菌或 表皮葡萄球菌液体培养物于盖玻片中央。（3）把凹玻片凹面朝下盖在盖玻片上，使 凹窝中央正对菌液（见图211）。（4）迅速翻转凹玻片，使粘附在凹玻片上 的盖玻片朝上。（5）先用低倍镜观察，再换高倍镜观察。 图211悬滴法 普通变形杆菌有鞭毛，运动活泼，可向不同方向迅速运动。表皮葡萄球菌无鞭毛，不能作真正运动，只能在一定范围内作移位不大的颤动，这是受水分子撞击而呈分子运动（即布朗运动）。2、压滴法（1）用接种环取34环菌液于洁
4、净载玻片中央。（2）用小镊子挟一块盖玻片轻轻覆盖在载玻片的菌液上，放置盖玻片时，应将盖玻片的一端接触载玻片，然后缓慢放下，以免菌液中产生气泡。（3）先用低倍镜对光找到细菌的位置，再换高倍镜观察细菌的运动。【思考题】1、在油镜下你看到了细菌有几种特殊机构？能否看到细菌菌毛？2、细菌特殊结构在医学上有何意义？3、细菌的动力检查有何意义？实验二 细菌涂片标本的制备及革兰染色法【目的】1、掌握细菌涂片标本的制备和革兰染色法。2、了解革兰染色法的意义。【原理】1、细胞壁结构学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇容易渗
5、入。2、等电点学说：革兰阳性菌等电点（pH23）比革兰阴性菌等电点（pH45）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易被95%乙醇脱色。3、化学学说：革兰阳性菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合成大分子复合物，使已经着色的细菌不被95%乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故容易被95%乙醇脱色。【材料】1、菌种：大肠埃希菌、葡萄球菌。2、染液:革兰染色液一套：结晶紫染液、碘液、95%乙醇、稀释石炭酸复红染液。3、玻片、生理盐水、酒精灯、吸水纸、接种环、玻璃蜡笔、香柏油等。【方法】一 细菌涂片制备1、涂片：取一张洁净载
6、玻片，用玻璃蜡笔在洁净载玻片上标记，于玻片两端各滴1滴生理盐水，不要太靠近玻片边沿。接种环在火焰上灭菌后，分别挑取少量葡萄球菌和大肠埃希菌于玻片两端的生理盐水中，并研磨成均匀混浊的菌液（如系液体标本，则不需加生理盐水，可直接涂于载玻片上），涂成约1cm1cm大小的均匀薄膜，接种环灭菌后放回试管架上。2、干燥：涂片最好在室温下自然干燥，如欲加速干燥，也可将涂膜背面置火焰上方不烤手的高处略加烘烤，但切勿紧靠火焰，以免将涂膜烤焦，细菌变形，染色后难以观察。3、固定：涂片干燥后，手持玻片的一端，将载玻片的背面往返通过酒精灯火焰三次，共约23秒钟，注意温度不可太高，以玻片加温面触及皮肤感觉烫而尚能忍受为
7、度。固定的目的一是杀死细菌，二是使菌体与玻片粘附牢固，以免玻片上的细菌在染色过程中被水冲洗掉，三是固定后细菌蛋白质变性易被着色。固定完毕，放置待冷后再进行染色。 注：无论何种染色，涂片均不可太厚，一定涂成薄膜；取第二个菌之前，一定要注意灭菌，否则两菌混淆；最好取湿润的菌落，便于将细菌混匀。二 革兰染色法1、初染：将固定好的细菌涂片放在染色架上，滴加结晶紫染液23滴，以全面覆盖涂膜为度，染色1min后用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻洒净。2、媒染：滴加卢戈（Lugol）碘液数滴，染色1min后用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻洒净。3、脱色：滴加95%乙醇数滴，轻轻前后摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，然后
8、倾斜玻片，使脱掉的染料随乙醇流去，再滴加乙醇，如此反复23次，直到流下的乙醇无色或稍呈淡紫色为止，大约30s左右，用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻洒净。4、复染：滴加稀释石炭酸复红液数滴，复染1min，用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻洒净。 待标本片自然干燥或用吸水纸吸干后，在涂菌处滴加一滴香柏油，然后用油镜观察结果。【结果】 染成紫色的为革兰阳性菌；染成红色的为革兰阴性菌。【注意事项】1、涂片应均匀，如太厚或太薄，菌体分散不均，会影响乙醇脱色，造成染色结果不准确。固定时应避免菌体过分受热，否则会使菌体变形影响染色效果。脱色时应把握好时间，若脱色时间过长易造成假阴性，但脱色时间过短革兰阴性菌也会被
9、误认为革兰阳性菌。2、所用染色液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是碘液久存或受光作用后可形成碘酸，易失去媒染作用。脱色用的乙醇以95%浓度为好，若瓶口密封不好或涂片上积水过多，均可引起乙醇浓度降低而增强脱色能力。3、不同时间的细菌培养物，染色结果有差异。如葡萄球菌，培养48h以上的老龄菌，易染成红色，而幼龄菌则易染成紫色。细菌染色一般用1824h的细菌培养物。4、染色过程中勿使染色液干凅，用水冲洗后应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。【思考题】1、为什么接种环（针）使用前后都必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害？2、制备一张好的涂片应注意些什么？3、如革兰阳性菌被染成革兰阴性菌可能有哪
10、些原因？【附录】1、革兰染色液的配制（1）结晶紫染液：称取结晶紫48g，溶于95乙醇100ml中，配成结晶紫乙醇饱和液。取此饱和液20ml与1草酸铵水溶液80ml混匀，过滤后备用。（2）卢戈（Lugol）碘液：先将碘化钾2g溶于10ml蒸馏水中，再加入碘1g，略加振摇，使之全部溶解后，再加蒸馏水至300ml既成。2、鞭毛染色法（魏曦染色法）（1）染液： 甲液：钾明矾饱和液2ml，50gL石炭酸液5ml，200gL鞣酸液2ml，混匀。 乙液：碱性复红乙醇饱和液。 使用前，将甲液9份，乙液1份混合后过夜，次日过滤后使用，3天内使用效果最佳。此液不能长期保存。（2）染色方法： 先将鞭毛菌在肉汤培养基
11、中传代67次。取琼脂斜面培养基吸出凝结水，加入2ml无菌蒸馏水，然后将肉汤中传代的细菌接种于斜面琼脂与液体交界处，再从该交界处向上划一直线，放人温箱中培养16h。用接种环从交界处取一环菌液，轻轻放人盛有34ml蒸馏水的小碟液体表面，使细菌自由分散，浮在液体表面，静置于温箱内45min后，用接种环取一环液面混合液放于高度洁净的载玻片上，切勿研磨和摇动，置37或室温下让其自然干燥，切勿火焰固定，加数滴染液染色12min，轻轻水洗，干后用显微镜油镜观察。（3）结果：细菌菌体和鞭毛均染成红色，菌体着色较鞭毛深。染色时间长则鞭毛粗，否则鞭毛较细。3、荚膜染色法（黑斯染色法）（1）染液：结晶紫染液：结晶紫
12、饱和乙醇溶液5ml，加蒸馏水95ml混合；200g/L硫酸铜水溶液。（2）染色方法：将荚膜菌涂片，在空气中自然干燥，无需加热固定，滴加结晶紫染液，在火焰上微微加热，使玻片上染液冒蒸汽为止。再用硫酸铜水溶液冲洗，切勿用水冲洗。待干后油镜检查。（3）结果：细菌菌体染成紫色，荚膜染成淡紫色。4、芽胞染色法(复红美兰法)（1）染液:石炭酸复红液，95乙醇，碱性美兰液(配法：取美兰2g，溶于95乙醇 100ml中配成美兰乙醇饱和液。取此饱和液30ml与0.0lKOH水溶液100ml均匀混合即成)。（2）染色方法：将有芽胞的细菌培养物涂片，自然干燥后，火焰固定。滴加数滴石炭酸复红染液于涂片上，并用微火加温
13、，使染液冒蒸汽，持续5min，冷却后用流水轻轻冲洗；用95乙醇脱色2min，流水轻轻冲洗；再加数滴碱性美兰染液复染0.5min，流水轻轻冲洗，干后油镜检查。（3）结果：细菌菌体染成蓝色，芽胞染成红色。实验三 常用培养基制备【目的】1、熟悉培养基制备的基本程序。2、掌握常用培养基的种类及用途。【材料】1、试剂：牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、脱纤维绵羊血或兔血、蒸馏水、1N的NaOH、1N的HCl等。2、器材：三角烧瓶、量筒、精密pH试纸、天平、高压蒸气灭菌器、脱脂棉、滤纸、漏斗、无菌平皿、酒精灯、电炉、血清凝固器等。【方法】一 培养基制备的基本程序制备一般培养基的基本程序可分为：调配、溶化、矫
14、正pH、过滤、分装、灭菌、鉴定和保存等步骤。1、调配：按培养基组成准确称取各成分用量，放人三角烧瓶或大容量烧瓶中，加一定量蒸馏水，振摇后使其充分混匀。应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH后加入。2、溶化：将调配好的混合物在电炉上加热，随时搅拌，防止外溢，使其完全溶化。溶化完毕，注意补足失去的水分。3、矫正pH：可用pH比色法或精密pH试纸，矫正培养基的pH，pH 矫正方法见附录，一般将培养基的pH调至7.27.6左右。经高压灭菌后，其pH值约降低0.10.2，故在矫正pH时应比实际需要的pH高 0.10.2。4、滤过：自配的培养基通常有一些混浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。液体或半固体培养基
15、常用滤纸过滤，固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。如称取的为半成品成分则不需要过滤。5、分装：根据需要将培养基分装于三角烧瓶或试管等。（1）基础培养基：一般分装于三角烧瓶内，灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；（2）琼脂斜面：通常在熔化后分装于试管，量约为试管高度的1413，加塞后灭菌，趁热摆成斜面，斜面长度约为试管长度的23，且保持试管下端有lcm柱高；（3）半固体培养基：分装量约为试管容量的1413，加塞灭菌后趁热直立，凝固待用；（4）琼脂高层培养基：分装量约为试管长度的13，灭菌后趁热直立凝固待用；（5）液体培养基：分装量约为试管长度的13，灭菌后趁热直立待用；（6）琼脂平板：先将灭菌加热熔化后的固体培养基，冷至50左右，以无菌操作倾注于无菌平皿内。内径9cm的平皿约1315m1，若内径7cm的平皿约78m1，轻摇平皿，使培养基平铺于平皿底部，待凝固后将平皿翻转，置4保存备用。6、灭菌：（1）高压蒸汽灭菌：耐热物质配制成的培养基(如普通培养基等)常用高压蒸气灭菌，通常压力在10343kPa（1.05kgcm2）蒸气压力下，温度达到121.3，维持1530min；含糖培养基加热10磅（6895k
