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1、细菌与真菌学实验实验一 细菌形态结构观察【目的】1、了解细菌的基本形态和特殊结构观察法2、明确细菌特殊结构在医疗实践中的意义3、细菌不染色标本的观察方法4、观察活细菌的形态及运动情况【材料】 革兰染色标本片:1、球菌:葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。2、杆菌:伤寒沙门菌、大肠埃希菌、炭疽芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌。3、螺形菌:霍乱弧菌或水弧菌。细菌特殊结构标本片:1、鞭毛:变形杆菌、 霍乱弧菌2、荚膜:肺炎链球菌、 产气荚膜杆菌3、芽孢:破伤风杆菌、 炭疽杆菌细菌动力观察材料:1、菌种:普通变形杆菌、表皮葡萄球菌。2、变形杆菌和表皮葡萄球菌812min肉汤培养物。3、其他:凹玻片、盖玻
2、片、凡士林、牙签、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸一 细菌形态结果观察1、使用油镜观察上述革兰染色标本片:认识细菌的三种基本形态。注意观察各菌的形态、大小、排列方式及染色性等特点。2、使用油镜观察细菌的特殊结构标本片:(1)荚膜:肺炎链球菌经革兰染色后,呈矛头状成双排列,菌体四周有不着色的透明圈(既荚膜);肺炎链球菌与产气荚膜杆菌的荚膜(荚膜染色法),注意观察菌体及荚膜的颜色及两者的形态特点。(2)鞭毛:变形杆菌与霍乱弧菌的鞭毛(鞭毛染色法),注意观察菌体和鞭毛的颜色、鞭毛的长短、数目及在菌体上的位置。(3)芽胞:破伤风梭菌及炭疽杆菌芽胞(芽胞染色法),注意观察菌体、芽孢的形态、颜色及芽
3、孢在菌体中的位置。二、细菌不染色标本观察法(动力观察法)1、悬滴法图211(1)取一张洁净盖玻片,用牙签涂少许 凡士林于盖玻片的四个角处。(2)用接种环取34环普通变形杆菌或 表皮葡萄球菌液体培养物于盖玻片中央。(3)把凹玻片凹面朝下盖在盖玻片上,使 凹窝中央正对菌液(见图211)。(4)迅速翻转凹玻片,使粘附在凹玻片上 的盖玻片朝上。(5)先用低倍镜观察,再换高倍镜观察。 图211悬滴法 普通变形杆菌有鞭毛,运动活泼,可向不同方向迅速运动。表皮葡萄球菌无鞭毛,不能作真正运动,只能在一定范围内作移位不大的颤动,这是受水分子撞击而呈分子运动(即布朗运动)。2、压滴法(1)用接种环取34环菌液于洁
4、净载玻片中央。(2)用小镊子挟一块盖玻片轻轻覆盖在载玻片的菌液上,放置盖玻片时,应将盖玻片的一端接触载玻片,然后缓慢放下,以免菌液中产生气泡。(3)先用低倍镜对光找到细菌的位置,再换高倍镜观察细菌的运动。【思考题】1、在油镜下你看到了细菌有几种特殊机构?能否看到细菌菌毛?2、细菌特殊结构在医学上有何意义?3、细菌的动力检查有何意义?实验二 细菌涂片标本的制备及革兰染色法【目的】1、掌握细菌涂片标本的制备和革兰染色法。2、了解革兰染色法的意义。【原理】1、细胞壁结构学说:革兰阳性菌细胞壁结构较致密,肽聚糖层厚,脂质含量少,乙醇不易渗入;革兰阴性菌细胞壁结构疏松,肽聚糖层薄,含大量脂质,乙醇容易渗
5、入。2、等电点学说:革兰阳性菌等电点(pH23)比革兰阴性菌等电点(pH45)低,在相同pH条件下,革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多,故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固,不易被95%乙醇脱色。3、化学学说:革兰阳性菌菌体含有大量核糖核酸镁盐,可与碘、结晶紫牢固结合成大分子复合物,使已经着色的细菌不被95%乙醇脱色;革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少,故容易被95%乙醇脱色。【材料】1、菌种:大肠埃希菌、葡萄球菌。2、染液:革兰染色液一套:结晶紫染液、碘液、95%乙醇、稀释石炭酸复红染液。3、玻片、生理盐水、酒精灯、吸水纸、接种环、玻璃蜡笔、香柏油等。【方法】一 细菌涂片制备1、涂片:取一张洁净载
6、玻片,用玻璃蜡笔在洁净载玻片上标记,于玻片两端各滴1滴生理盐水,不要太靠近玻片边沿。接种环在火焰上灭菌后,分别挑取少量葡萄球菌和大肠埃希菌于玻片两端的生理盐水中,并研磨成均匀混浊的菌液(如系液体标本,则不需加生理盐水,可直接涂于载玻片上),涂成约1cm1cm大小的均匀薄膜,接种环灭菌后放回试管架上。2、干燥:涂片最好在室温下自然干燥,如欲加速干燥,也可将涂膜背面置火焰上方不烤手的高处略加烘烤,但切勿紧靠火焰,以免将涂膜烤焦,细菌变形,染色后难以观察。3、固定:涂片干燥后,手持玻片的一端,将载玻片的背面往返通过酒精灯火焰三次,共约23秒钟,注意温度不可太高,以玻片加温面触及皮肤感觉烫而尚能忍受为
7、度。固定的目的一是杀死细菌,二是使菌体与玻片粘附牢固,以免玻片上的细菌在染色过程中被水冲洗掉,三是固定后细菌蛋白质变性易被着色。固定完毕,放置待冷后再进行染色。 注:无论何种染色,涂片均不可太厚,一定涂成薄膜;取第二个菌之前,一定要注意灭菌,否则两菌混淆;最好取湿润的菌落,便于将细菌混匀。二 革兰染色法1、初染:将固定好的细菌涂片放在染色架上,滴加结晶紫染液23滴,以全面覆盖涂膜为度,染色1min后用细流水冲洗,将玻片上积水轻轻洒净。2、媒染:滴加卢戈(Lugol)碘液数滴,染色1min后用细流水冲洗,将玻片上积水轻轻洒净。3、脱色:滴加95%乙醇数滴,轻轻前后摇动玻片数秒钟,使均匀脱色,然后
8、倾斜玻片,使脱掉的染料随乙醇流去,再滴加乙醇,如此反复23次,直到流下的乙醇无色或稍呈淡紫色为止,大约30s左右,用细流水冲洗,将玻片上积水轻轻洒净。4、复染:滴加稀释石炭酸复红液数滴,复染1min,用细流水冲洗,将玻片上积水轻轻洒净。 待标本片自然干燥或用吸水纸吸干后,在涂菌处滴加一滴香柏油,然后用油镜观察结果。【结果】 染成紫色的为革兰阳性菌;染成红色的为革兰阴性菌。【注意事项】1、涂片应均匀,如太厚或太薄,菌体分散不均,会影响乙醇脱色,造成染色结果不准确。固定时应避免菌体过分受热,否则会使菌体变形影响染色效果。脱色时应把握好时间,若脱色时间过长易造成假阴性,但脱色时间过短革兰阴性菌也会被
9、误认为革兰阳性菌。2、所用染色液应防止水分蒸发而影响浓度,特别是碘液久存或受光作用后可形成碘酸,易失去媒染作用。脱色用的乙醇以95%浓度为好,若瓶口密封不好或涂片上积水过多,均可引起乙醇浓度降低而增强脱色能力。3、不同时间的细菌培养物,染色结果有差异。如葡萄球菌,培养48h以上的老龄菌,易染成红色,而幼龄菌则易染成紫色。细菌染色一般用1824h的细菌培养物。4、染色过程中勿使染色液干凅,用水冲洗后应甩去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果。【思考题】1、为什么接种环(针)使用前后都必须烧灼灭菌?忽略了有什么危害?2、制备一张好的涂片应注意些什么?3、如革兰阳性菌被染成革兰阴性菌可能有哪
10、些原因?【附录】1、革兰染色液的配制(1)结晶紫染液:称取结晶紫48g,溶于95乙醇100ml中,配成结晶紫乙醇饱和液。取此饱和液20ml与1草酸铵水溶液80ml混匀,过滤后备用。(2)卢戈(Lugol)碘液:先将碘化钾2g溶于10ml蒸馏水中,再加入碘1g,略加振摇,使之全部溶解后,再加蒸馏水至300ml既成。2、鞭毛染色法(魏曦染色法)(1)染液: 甲液:钾明矾饱和液2ml,50gL石炭酸液5ml,200gL鞣酸液2ml,混匀。 乙液:碱性复红乙醇饱和液。 使用前,将甲液9份,乙液1份混合后过夜,次日过滤后使用,3天内使用效果最佳。此液不能长期保存。(2)染色方法: 先将鞭毛菌在肉汤培养基
11、中传代67次。取琼脂斜面培养基吸出凝结水,加入2ml无菌蒸馏水,然后将肉汤中传代的细菌接种于斜面琼脂与液体交界处,再从该交界处向上划一直线,放人温箱中培养16h。用接种环从交界处取一环菌液,轻轻放人盛有34ml蒸馏水的小碟液体表面,使细菌自由分散,浮在液体表面,静置于温箱内45min后,用接种环取一环液面混合液放于高度洁净的载玻片上,切勿研磨和摇动,置37或室温下让其自然干燥,切勿火焰固定,加数滴染液染色12min,轻轻水洗,干后用显微镜油镜观察。(3)结果:细菌菌体和鞭毛均染成红色,菌体着色较鞭毛深。染色时间长则鞭毛粗,否则鞭毛较细。3、荚膜染色法(黑斯染色法)(1)染液:结晶紫染液:结晶紫
12、饱和乙醇溶液5ml,加蒸馏水95ml混合;200g/L硫酸铜水溶液。(2)染色方法:将荚膜菌涂片,在空气中自然干燥,无需加热固定,滴加结晶紫染液,在火焰上微微加热,使玻片上染液冒蒸汽为止。再用硫酸铜水溶液冲洗,切勿用水冲洗。待干后油镜检查。(3)结果:细菌菌体染成紫色,荚膜染成淡紫色。4、芽胞染色法(复红美兰法)(1)染液:石炭酸复红液,95乙醇,碱性美兰液(配法:取美兰2g,溶于95乙醇 100ml中配成美兰乙醇饱和液。取此饱和液30ml与0.0lKOH水溶液100ml均匀混合即成)。(2)染色方法:将有芽胞的细菌培养物涂片,自然干燥后,火焰固定。滴加数滴石炭酸复红染液于涂片上,并用微火加温
13、,使染液冒蒸汽,持续5min,冷却后用流水轻轻冲洗;用95乙醇脱色2min,流水轻轻冲洗;再加数滴碱性美兰染液复染0.5min,流水轻轻冲洗,干后油镜检查。(3)结果:细菌菌体染成蓝色,芽胞染成红色。实验三 常用培养基制备【目的】1、熟悉培养基制备的基本程序。2、掌握常用培养基的种类及用途。【材料】1、试剂:牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、脱纤维绵羊血或兔血、蒸馏水、1N的NaOH、1N的HCl等。2、器材:三角烧瓶、量筒、精密pH试纸、天平、高压蒸气灭菌器、脱脂棉、滤纸、漏斗、无菌平皿、酒精灯、电炉、血清凝固器等。【方法】一 培养基制备的基本程序制备一般培养基的基本程序可分为:调配、溶化、矫
14、正pH、过滤、分装、灭菌、鉴定和保存等步骤。1、调配:按培养基组成准确称取各成分用量,放人三角烧瓶或大容量烧瓶中,加一定量蒸馏水,振摇后使其充分混匀。应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH后加入。2、溶化:将调配好的混合物在电炉上加热,随时搅拌,防止外溢,使其完全溶化。溶化完毕,注意补足失去的水分。3、矫正pH:可用pH比色法或精密pH试纸,矫正培养基的pH,pH 矫正方法见附录,一般将培养基的pH调至7.27.6左右。经高压灭菌后,其pH值约降低0.10.2,故在矫正pH时应比实际需要的pH高 0.10.2。4、滤过:自配的培养基通常有一些混浊或沉淀,需滤过澄清后方可使用。液体或半固体培养基
15、常用滤纸过滤,固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。如称取的为半成品成分则不需要过滤。5、分装:根据需要将培养基分装于三角烧瓶或试管等。(1)基础培养基:一般分装于三角烧瓶内,灭菌后备用,以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等;(2)琼脂斜面:通常在熔化后分装于试管,量约为试管高度的1413,加塞后灭菌,趁热摆成斜面,斜面长度约为试管长度的23,且保持试管下端有lcm柱高;(3)半固体培养基:分装量约为试管容量的1413,加塞灭菌后趁热直立,凝固待用;(4)琼脂高层培养基:分装量约为试管长度的13,灭菌后趁热直立凝固待用;(5)液体培养基:分装量约为试管长度的13,灭菌后趁热直立待用;(6)琼脂平板:先将灭菌加热熔化后的固体培养基,冷至50左右,以无菌操作倾注于无菌平皿内。内径9cm的平皿约1315m1,若内径7cm的平皿约78m1,轻摇平皿,使培养基平铺于平皿底部,待凝固后将平皿翻转,置4保存备用。6、灭菌:(1)高压蒸汽灭菌:耐热物质配制成的培养基(如普通培养基等)常用高压蒸气灭菌,通常压力在10343kPa(1.05kgcm2)蒸气压力下,温度达到121.3,维持1530min;含糖培养基加热10磅(6895k