纳米抗体筛选实验步骤

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1、纳米抗体筛选一、纳米抗体简介1.纳米抗体发现及结构1993年，Hamers -Casterman 教授以及他的同事们在骆驼的血清中发现了一 种与传统抗体结构不同的新型抗体，这种抗体仅仅由两条重链构成，被称为重链 抗体（heavy -chain antibody, HCAb）。重链抗体的重链的可变区称为VHH（variable domain of heavy chain of heavy -chain antibody），通过体外重组表达制备的 VHH 分子质量仅仅为15kDa，是传统抗体的十分之一左右，是抗原结合片段（scFV, VH-VL）的二分之一左右，因此被称为纳米抗体（nanobody

2、, Nb）。CH2FCCH3传统抗体（左）、重链抗体（中）和纳米抗体（右）的结构CH2由于没有轻链，纳米抗体仅有3个属于重链的抗原识别区域（CDRs区）。 为了弥补缺少的轻链CDRs的生物学活性，纳米抗体在CDR3部分增加了氨基 酸长度（1618个氨基酸残基，对应的传统抗体的CDR3有8-15个氨基酸）， 以增加CDR的多样性和特异性。另外，纳米抗体的CDR3区域可形成一个大的 暴露的凸环，像“手指”一样延伸到抗原的缝隙或者裂口中，可以接触到传统抗体 不能接触的抗原表位。CDR3凸环中的一个半胱氨酸还可以与CDR1或FR2的 45位点的半胱氨酸形成二硫键，可使纳米抗体的生物结构相对稳定，大大降

3、低 纳米抗体与抗原结合所需能量，使得高亲和力的纳米抗体的获得较容易。纳米抗体和VH结构示意图2纳米抗体优势（1）纳米抗体理化特性较稳定（2）纳米抗体的大规模生产较容易实现（3）纳米抗体免疫原性低（4）纳米抗体分子量小，组织渗透能力强，血液清除较快（5）纳米抗体可以识别传统抗体不能识别的位点（ 6）纳米抗体具备形成多聚体的能力3.纳米抗体筛选Collie nonLymphocvte(synthetic librariesPhage displayAntigef) zpedjic AbBtQpannfngProductionNanobody纳米抗体筛选和制备纳米抗体的获得现在普遍通过免疫羊驼，从羊

4、驼体内自身的抗体成熟阶段来得到抗体基 因，然后通过噬菌体展示筛选技术来从羊驼抗体库中筛选得到高亲和力的抗体序列。整个流 程主要包括三个阶段：（1）羊驼免疫一只羊驼可以同时免疫1-5个抗原，每次免疫总的抗原量保持在l-2mg之间，体积在 2mL以下，纯化制备的抗原与佐剂进行1： 1乳化后对羊驼进行免疫，每2周免疫一次。 在每次免疫前进行采血用于免疫评价，采血从羊驼颈部静脉采取，每次取5ml血液，3000rpm 离心lOmin，分离保存上层血清。（2）噬菌体文库构建分离免疫后的羊驼外周血单个核细胞，提取总RNA后反转录得到cDNA文库，据设计 的引物在cDNA文库中扩增得到VHH片段。通过将抗体基

5、因克隆到相应噬菌体载体上 可以将外源基因插入噬菌体基因适当位置并随着随着噬菌体传代，最终使外源蛋白展现在子代噬菌体的表面。（3）纳米抗体筛选筛选的方法主要分为固相筛选和液相筛选两种。通过生物淘洗法、竞争法、消减法、选择性感染筛选、延迟性感染筛选等方法可以对和靶蛋白强力结合的基因片段筛 选出来。将靶点抗原或者带有抗原的物质直接/间接的固定在固体载体上，随后加 入噬菌体文库和抗原相互作用。作用一段时间后用洗涤液洗涤固体载体表面，可 以将未结合或非特异结合的噬菌体洗去。随后用强酸或者强碱破坏固体载体上抗 原和阳性噬菌体的结合，从而得到阳性噬菌体溶液。将其侵染大肠杆菌进、铺盘、 表达后进行ELISA鉴

6、定，一般重复进行2-3轮的筛选即可获得高亲和力的纳米 抗体克隆。二、噬菌体抗体库构建1.分离外周血单个核细胞（PBMC ）（1）将离心机预温至25口，在50ml离心管中分别加入15mlPBS和15ml新鲜血 液进行稀释，翻转数次混匀。（2）加15ml分离液于新50ml离心管中，向分离液管中加入稀释好的血液，小 心缓慢以防止血液和分离液混匀。（3）4500 g离心30min，观察离心管中血液分离情况，用200gl移液器小心吸取 出中间棉层免疫细胞至新的15ml离心管中，上层血清保存在新的离心管中，-80口保 存。（4）向单核细胞液中加入3倍体积PBS缓冲液混匀，400g离心15min。（5）去除

7、上清液，每管加入3mlPBS缓冲液混匀并进行细胞计数，400g离心20min -去除上清液，根据细胞数目使用 RNAiso Plus溶解分离得到的淋巴细胞108/mL溶解液，-80口保存。2. 总RNA提取（1）将羊驼PBMC样品从-80口冰箱中取出，分装0.5ml/管，每管中加入100皿 氯仿，在震荡器上剧烈震荡15s后，室温放置静置5min。（2）将离心机预冷至4口，12000g离心15min，离心后出现分层，将最上层的透明层用移液枪小心转移到新的无 RNase和DNase的1.5ml离心管中，每管加入250卩1 的异丙醇，上下颠倒多次混匀后室温放置静置10min。（3）12000g离心1

8、0min，去除上清保留沉淀。（4）每管加入1ml 75%乙醇，上下颠倒多次以悬浮沉淀。（5）7500g离心5min，去除上清保留沉淀。（6） 保持离心管口打开，室温放置干燥10min，每管加入DEPC处理水溶解， 55孵育10min以确保RNA完全溶解。（7）小心吸取至同一个离心管中，即为 PBMC中提取出的总RNA。3. CDNA文库的获取（1）将总RNA样品分为两份，一份使用试剂盒内的 Oligo dT Primer作为引物， 另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物，在1.5ml离心管中按下表比例配置反应液，当总RNA量大于5聘时，同比例扩大反应体系。试剂使用量Oligo d

9、T Primer （ 50gM） /Random 6-mers （ 50gM）1gldNTP Mix1gl总RNA5卩gddH2OUp to 10gl（2）将含有上述反应液的离心管放入金属加热器中，65口反应5min使RNA变性，反应结束后置于冰上迅速冷却。(3) 在上述1.5ml离心管中按下表比例配置反应液，当管内总体积大于10卩1时, 同比例扩大反应体系。试剂使用量反应液iom5xPrimeScript II Buffer4卩1RNase Inhibitor0.5卩1PrimeScript II RTase1g1ddH2OUp to 201(4) 缓慢混匀后，将含有上述反应液的离心管放入金

10、属加热器中，45C反应60min, 再75C反应15min，冰上冷却，即为总 RNA反转录后的cDNA , -20C保存。4噬菌体文库的构建4.1载体构建以cDNA为模板，根据设计的引物进行两轮巢式 PCR扩增得到VHH片段，回收第 一轮PCR 700bp处的片段作为第二轮PCR的模板，在第二轮PCR时引入合适的酶切位点， 扩增后回收400bp处的片段，即为所需的纳米抗体基因，随后将其克隆至合适的噬菌粒载体 上。4.2电转化大肠杆菌4.2.1大肠杆菌TG1电转感受态的制备(1) 在2xYT平板上划线培养大肠杆菌TG1，于37C培养箱中过夜培养。(2) 从平板上挑取TG1单菌落至5个含有5mL的

11、2xYT液体培养基的小试管中，然 后转接至10瓶含有200mL的2xYT培养基的锥形瓶中，37C 220 r/min培养至 OD600=0.6。(3) 将菌液放置冰上30 min，之后4C、4000 r/min离心10 min，弃上清，收集菌体。(4) 加入适量的超纯水重悬菌体，4C、4000 r/min离心10 min,弃上清，再重复该 步骤两次，注意冰上操作。(5) 将最终收集到的菌体用4.5 mL的超纯水重悬。4.2.2连接体系电转TG1感受态细胞(1) 将纯化得到的连接体系加入TG1感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打混匀。(2) 将加有连接体系的感受态细胞分装于电击杯中(-20C预冷)，每

12、个电击杯分装100 yL,冰上静置5 min。(3) 将电击杯放入电转化仪中电转，电转参数设置为2.5 kV, 25 yF, 200 0,电转完 成后立即加入 900 yL 的 SOC 培养基混匀。(4) 将电转杯中的培养基吸到500 mL的锥形瓶中，每个电击杯中加入1 mL SOC培 养基冲刷电转杯，之后将培养基吸到锥形瓶中，37C、180 r/min复苏1 h。(5) 4000 r/min将上述培养基离心10 min，倒掉上清，收集菌体，用5 mL的2xTY 培养基重悬菌体。(6) 吸出100 yL的重悬菌液，按照10-1、10-2到10-7梯度稀释，将各个梯度的菌 液各吸出100 yL涂

13、于90mm的2xYT-A平板上，于37C培养箱中过夜培养。将剩余菌 液涂于2xYT-A 150mm平板上，正放至菌液吸收后，将平板倒置于培养箱中37C过夜培养。(7) 对各稀释度平板上的单菌落计数，选择单菌落个数合适的平板，根据稀释度计算 文库的库容。根据以下公式计算文库库容：库容=第n次稀释度下的转化子数目x10n-1x (文库总体积/稀释所用体积)x(第n次稀释 液总体积/所涂稀释液体积)4.3纳米抗体文库的收集(1) 每个180 mm的平板上加入2 mL的2xYT液体培养基，用刮子刮下平板上的 菌体，用移液枪将菌体移至离心管中，再用2 mL的2xTY液体培养基冲刷平板，收集所 得菌液与离

14、心管中。(2) 4000 r/min离心10 min收集菌体，用15%甘油-2xYT培养基将菌体重悬至30 mL,混匀后将菌液置于-80C保存。44 VHH片段插入率的检测(1) 挑取平板上的30个单克隆于LB-amp中培养后进行菌液鉴定(2) 参照菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳结果，根据电泳位置确定插入VHH片段的个 数，计算文库的插入率。4.5VHH片段插入正确率及多样性的检测(1) 随机挑取平板上的 100 个单克隆送至测序公司测序验证。(2) 使用 CLC Sequence Viewer 软件比对分析测序结果。三、纳米抗体筛选1.M13K07辅助噬菌体的扩增及滴度测定(1) 从新鲜的 LB

15、 固体培养基上挑取大肠杆菌 TG1 单克隆菌株至含有 5mL LB 培养 基的小试管中，37C 220r/min培养至OD600=0.6。(2) 在TG1培养基中加入辅助噬菌体M13K07，使其终浓度达到1010个/mL, 37C 静置孵育45min,转接至两瓶含有250 mL 2xYT培养基的锥形瓶中，37C220r/min 培养 1 h。(3) 在培养基中加入终浓度为50卩g/mL的卡纳霉素抗生素(M13K07辅助噬菌体 具 有卡纳霉素抗性基因)， 37C 220 r/min 培养过夜。(4) 将培养物10,000 rpm 4C离心10 min,转移上清至干净的离心管中，加入1/5 体积的PEG/NaCl溶液，4C静置沉淀辅助噬菌体2 h。(5) 4 C 离心，10,000 rpm， 15 min,倒掉上清。(6) 用 1/20 体积的 PBS 缓冲液重悬所得辅助噬菌体沉淀， 4C， 12,000 rpm 离心20 min,缩聚不溶物，转移上清至干净的离心管中。(7) 重复步骤 4-5。用20 mL PBS-15%甘油重悬所得辅助噬菌体沉淀，4C静置过夜。(9) 4C, 12,000 rpm离