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1、哮喘豚鼠气道重构中基质金属蛋白酶作者：王光辉,金发光,楚东岭，段丽【关键词】 哮喘；气道重构；明胶酶B；金属蛋白酶1组织抑制剂 【bsrct】 IM: oinvstiat he oes omtrxmtallooin9 (MP9)ad isue inhibitr fmetallproteinse1 (TIMP1)n aray roeling f astaric guinea pis. METHODS: Gine pigs were sstizd itovabnounctedwith Al（H）3， ansubeqetly chalenged reaedlwith ovalbumin aeros.
2、Thegua gswer ramyvded inthecontrlgou，astmtic , 6, week grps Th eprssions ofMP9ad TIMP1 i bronhiad lugtises ere obsrvedb immnoistoisty cmbine with th micage anlysis levelsof MMP9mRN ad TIMPRNA were deermined by smiuataie PCR. REUL： Afterepeaed llrgen chln, smooth musclhpplasiawas obvios in gue ig bro
3、c.xpreinleels of MM9 and TIP1 n te pithlial cells ofbronh wer significant ighr in shmatc nimals thanthose ontrol grup. he epressio o MMP9 nashmatic gunea pigslun tises as 0.52.0 n4week group,0740.05 in 6week grou，048004 8wek rup , 0.210ncontrol oup (P0.）. T eprsinof MP1 in atatc guna pigs lungtisues
4、 was 0.60.4 in week grou，0.830.5 n 6ek group， 0.975 in 8weekgoup , 0.200.02 n contrl gou（P0.） Theesuts of iunotochemistry weconsistet with os of RTPR e prguaton o MP epresson ome slorthanIMP1 since the 4theek i sthmati nims.So rio MP9 IMP1ws decesed. CONCLSION： Th epresin ll ofMMP9an TMP1 wre clel c
5、orrlat with athma airwarmodelig,an the rati o MMP9/ IMP mayrflcte he degre osthma airway remodeling. 【Kyrds】 ahma； airway redelg; gainase ; tissue inito mtllprotinase 【摘要】 目的： 探讨哮喘豚鼠模型中基质金属蛋白酶(s)及其组织抑制因子(IM)在哮喘气道重构发病中的作用. 方法: 重复雾化吸人卵蛋白建立豚鼠哮喘气道重构模型. 实验分为对照组、哮喘激发4, 6和8 wk组. 免疫组化方法结合显微图像分析检测MMP9, TIP的表
6、达 半定量PC检测MM9及TIMP1mRNA水平. 结果: 哮喘各组动物均出现管壁增厚、平滑肌增生等气道重构的特征性改变. 哮喘豚鼠MP的RNA表达:哮喘4组为(5005),哮喘 wk组为（0.74005);哮喘 k组为（0.480.04）；对照组为（0.0.04）;哮喘各组与对照组组间比较差异有统计学意义（P.05）. 哮喘豚鼠TMP1的mRA水平:哮喘4w组为(0.30.04）；哮喘6wk组为（0.83.0）；哮喘8 w组为（.970.05);对照组为(0.200.02);哮喘各组与对照组组间比较差异有统计学意义(P0.05) 免疫组化的结果和RTPC的结果一致. 在哮喘各时段组中,MM9
7、的表达增高自第4 k时明显变缓,而MP仍持续增高，导致MMP/ TIM1比例下降.结论: 哮喘的气道重构与MMP9 和TIMP1的表达密切相关,而二者的比例可能反映气道重构的严重程度.【关键词】哮喘;气道重构；明胶酶B;金属蛋白酶1组织抑制剂 气道重构是气道反复炎症损伤与修复的结果,是造成哮喘患者不可逆气道阻塞的病理生理基础，主要表现为细胞外基质(extracllu arix, EM）的沉积、基底膜增厚、气道平滑肌增生和肥厚等改变. 其中ECM在气道壁沉积过多是引起气道壁纤维化和气流阻塞的主要原因之一1. 正常ECM的合成与降解处于一个动态平衡之中，基质金属蛋白酶9(matrixmtllopr
8、oeases， MM9）与基质金属蛋白酶抑制因子1(tisuinibior of alloonas, TIP1）平衡是维持ECM内环境稳定的决定因素.本实验通过复制豚鼠哮喘模型,利用免疫组化和RTPR方法测量不同阶段哮喘豚鼠模型肺中MP及TM1含量变化,并了解Ms/TM在哮喘发病中的作用 1材料和方法1.1材料卵蛋白、结合生物素的羊抗兔G血清、ABC复合物均购自美国igm公司；兔抗TIMP1抗体、兔抗P9抗体购自武汉博士德公司;Trizl试剂购自美国Initrogn公司；Taq酶购自日本Promeg公司；MMP和MP1上下游引物由北京奥科公司合成;402型超声雾化吸入器购自上海合力医疗器械厂;
9、PC10型PCR仪为美国oRb公司产品；雄性豚鼠3只，体质量0020 g,由第四军医大学试验动物中心提供.1.方法 121动物分组及模型制备实验动物随机分为对照组和哮喘4， 6和8 k组，每组8只各哮喘组于第1日腹腔注射卵蛋白(含等量氢氧化铝凝胶)0.1 mg, 后雾化吸人1gL浓度的卵蛋白溶液激发哮喘,隔日次，每次20min,根据分组分别激发4，6和8.第1次激发后豚鼠即开始喘息,表现为呼吸加深加快,肋间隙凹陷,哮喘发作严重者可出现窒息；喘息后即将动物移出瓶外，喘息可持续30min，甚至更长；对照组同样于第日腹腔注射生理盐水0.9 g,1wk后将动物置于半封闭玻璃罩内雾化吸人生理盐水约20
10、min，隔日1次,雾化吸入生理盐水8wk. 1.2动物模型肺组织取材、固定、切片各组模型于末次激发48h后以戊巴比妥钠腹腔注射(0 mgkg)麻醉豚鼠，开胸留取豚鼠左肺置于液氮中速冻，70保存备用,经肺动脉灌注1 mL生理盐水,继以新配制的4g/多聚甲醛PB（.1 mol/L,p 7.4）60 mL持续灌注9 min,并将右肺取下后固定2 h,入200g/L蔗糖+含氟PB溶液中,4过夜至标本下沉，OCT包埋,恒冷箱切片机连续切片（厚15 ),-2保存备用. 1.23免疫组化染色肺组织切片贴于载玻片上,室温干燥0 mn后，以0. mol/L KBS(p 7.)浸洗,经800 mL/L甲醇+30
11、mL H2O2封闭 min，PBS浸洗3次1 in,切片入兔抗MP血清(100）室温孵育24 h. KBS浸洗3次1 min,入结合生物素的羊抗兔IgG血清(500),室温孵育2 h，KPBS浸洗次10 in，入ABC复合物(1500)室温孵育2h，葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺法显色.显色反应终止后,常规脱水,中性树胶封片. 同样方法利用兔抗TIMP1染色切片. 每张切片在显微镜下随机选取5个支气管，以棕黄色颗粒在胞质的沉积为阳性. 图像分析各支气管细胞染色的平均密度以代表MMP9, TIMP的表达强度.1249及MP1半定量PC用rzo试剂提取备用肺组织总;合成D；半定量PCR反应体系：a酶3
12、.34 nka,ufer 2，dNTP (10 m/L) L，MM9上游引物(5AAGGATCTACTGCA)0 mlL, L，P下游引物(5GAAGATGAATGGAAATCC3, 0 o/L,）. L,模板1 L,总反应体积20L. 反应条件:94 1 mn;564 s; min，个循环 TIMP1引物：上游5ACAGCTTCTCAACTCG3，下游5CATGTTTCGAACC3,P产物长度为64 b；条件:8，变性10 min,然后再94变性1 min，6 退火 s,延伸 min，共35个循环，最后,72延伸10in. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后采用凝胶成像分析系统读取其灰度值. 统计
13、学处理：各组间数据以表示,采用SS1.0统计软件进行统计分析,采用E AOA分析，组间两两比较采用Kq检验,P0.5为差异有统计学意义. 2结果.1哮喘动物模型的制作本实验中对照组豚鼠每次雾化吸人生理盐水均未见动物发生哮喘;各哮喘组第次雾化吸人卵蛋白溶液可见哮喘发作，约激发次可见明显哮喘发作,哮喘发作重者甚至可窒息致死. .组织病理学改变各组豚鼠肺组织冰冻切片光镜下见:哮喘各组细支气管上皮变性，细胞脱落，支气管黏膜皱襞增多,肺泡隔增厚明显，并随着激发时间的增长逐渐增厚，在哮喘 wk组表现最为明显 对照组豚鼠肺组织支气管及肺泡结构正常(图）.MP9及T1在豚鼠模型肺组织的表达结果显示，哮喘各组与对照组比较差异有统计学意义(.0)，其中MP的表达6wk组高于4 k组和8 wk组(005)在TIM1的表达中,8 wk组均高于 w组和4 k组(0.1）,6 w组则高于4 k组
