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1、题目：PEG促细胞融合实验目的:1. 掌握细胞融合的方法2. 学习使用PEG促进细胞融合的方法和步骤二实验原理1. 细胞融合：在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上 的细胞合并形成一个细胞的过程。由于体外培养的细胞很少会发 生自发融合融合频率 大约在10-4-10-6之间，因此要采用生物、 化学或物理的方法人为地促使细胞 融合。2. 促进细胞融合的方法a) 生物方法：病毒(Sendai virus， Newcastle disease virus， Vaceine virus)b) 化学方法：聚乙二醇、盐类融合剂、二甲亚砜(DMSO)、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂 质、
2、Ca2+配合物等。PEG相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏 散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发生融合。在众多的化学试剂中，PEG应用最为广泛，因PEG液比病毒 更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。c) 物理方法：电融合:电处理融合法是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，是 融合率大为提高。 电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱，出现小孔洞。而相对的 脂 双层间分子在范德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接 处的细胞膜表面曲
3、率大， 处于高张力状态，在热力学上是不 稳定的，所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆 形的大球状 细胞。与WG法比较，电融合法融合率高：重复性强：诱导仅发生 在 质膜接触部位，对细胞或原生质体伤害小：融合是在同步 状态下进行，活细胞数目 多；装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录象融合过程：免去PEG诱导后的 洗涤过程， 诱导过程可控制性强。三实验材料及设备1. 实验材料：a) 50%PEG混合液b) 鸡红细胞悬液c) 生理盐水d) Hanks 溶液2. 实验设备：a) 普通光学显微镜b) 载玻片若干，注射器c) 酒精灯、恒温水浴锅d) 离心管若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等1. 制取鸡血红
4、细胞悬液2. 取细胞悬液ImL,移入10mL离心管，加入4mL0. 85%生理盐 水混匀。1200r/min离心5min。3. 弃上清液(用吸管吸去)，加085%生理盐水至5mL，混匀 后1200r/min离心5min。重复上述步骤，再离心洗涤一次4. 收集最后一次离心沉淀的血细胞，加入适量的 Hanks 液， 按压积红细胞体积的 9 倍溶液配成 10%的红细胞悬液(浓 度约为3-4万个/mL)5. 取上述悬液 1mL 到一个试管中，加入 0.5-0.8mL 预热的 50%PEG混匀，置于37C水浴中温浴2min (再加入Ringer 或Hanks液5mL以终止PEG的作用；6. 取悬液一滴滴
5、于载玻片上,再加入0.2%次甲基蓝溶液1滴, 盖上盖玻片。7. 利用光学显微镜观察两个靠近细胞或三个细胞形成融合的 过程进行多个视野的测定，统计平均融合率。五实验结果图 1 光镜下不同融合程度的鸡血红细胞 ,100x图 2 染色后观察到的多核鸡红细胞图 3 多视野统计融合率， 40x视野1视野2视野3平均融合率-15.7%融合细胞核数726468细胞核总数121010融合率16.7%15.6%14.7%在光镜下可见单个椭圆状的鸡血红细胞，在经由PEG处理后，互相 接触的鸡血红细胞发生融合，可见相互接触的红细胞逐渐融合组成一 个更大的细胞结构。由于实验过程中PEG处理时间过长，且摇晃过度， 所以
6、可见大量细胞聚集而成的褐红色团块。六实验讨论1. 实验结论：本实验使用 PEG 溶液处理鸡血红细胞促进其细胞融合，从实 验结果可知，鸡血红细胞之间出现了不同程度的融合现象。还出 现了不同程度的融合现象，形成褐色团块。2. 讨论一：细胞融合方法主要有哪几类？各有何优缺点？几类细胞融合方法的优缺点如下：1. 病毒介导的细胞融合：优点是对细胞毒性较小，融合细胞易于 存活；缺点为使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭 活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方 法。2. 化学介导的细胞融合：优点是操作简便、快速省时且融合效果好；缺点为PEG对细胞有毒性，处理不好则会直接影响融合细 胞的
7、存活率。3. 电激法：优点是对细胞无毒性，且操作简单；缺点为它除需要 电融合仪外，还要求实验人员接受一定的技术训练。3. 讨论二：本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞?为什么？本实验所用PEG融合方法不能直接用于未脱壁植物细胞的融合， 因为植物细胞具有细胞壁，PEG无法介导其细胞融合；但是，如果 将植物细胞进行脱壁处理后，则可使用PEG融合方法进行融合实 验。4. 讨论三：和其他同学比较，为什么出现了较多褐色团块？ 影响PEG融合的因素还有哪些？在加入PEG后，为了使PEG与细胞充分接触，过度摇晃离心 管，导致被PEG破坏的细胞凝集，破裂，形成了大量褐色团块。其他影响因素：1. PEG
8、的分子量与浓度：细胞融合效果与PEG的分子量及其 浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高，对细胞的毒性也 就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为 10004000，浓度一般为4060%。2. PEG的pH值：经验证，PEG的pH值在8. 082之间融合 效果最好。3. PEG的处理时间：处理时间越长，融合效果越好，但对细 胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实 验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故 细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效 果, 在细胞可能承
9、受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于 哺乳动物的细，一般采用的温度为3840C。七参考文献1 DOS REMEDIOS CG, CHHABRA D, KEKIC M, et al. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments.J. 2(2):433-4732 翟中和，王喜忠，丁明孝等.细胞生物学M.高等理科教育，2004(1):123- 128.3 王惠，郭峰，关超，等.PEG介导细胞融合最适条件的探讨J.动物医学进 展,2012,(12):145-148. DOI:10.3969/j.issn.1007-5038.2012.12.034.
