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1、 毕 业 论 文题 目:乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 姓 名: 张珊 学 号: 系 别: 年 级: 专 业: 医学检验 指导教师: 二 一 一 年 十二 月目 录中文文献英文摘要前 言。1. 材料与方法。1.1 试剂盒1.2 仪器1.3 方法1.3.2铺板方案1.3.3加样步骤2. 结果2.1 标准曲线与线性范围2.2 准确度(回收率)的验证22.3 精密度的验证2.3.1 板内精密度的验证2.3.2 板间精密度的验证2.4 检测限(LOD)计算53. 讨论53.1 乙肝表面抗原定量分析的意义53.2 常用定量分析方法63.3 方法概述63.4 方法学验证内容63.5 结果分析
2、及应用评价7参考文献7 乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证摘 要目的:对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证,以判断是否能用于临床样本分析。方法:ELISA法定量分析,应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线,以6,3,1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度,精密度和检测限等方法学验证。结果:标准曲线R2=0.997,准确度97.07%,1.5ng/ml的RSD为16.78%,不满足ng/ml级水平的RSD一般应15%的要求,检测限LOD为0.172ng/ml,低浓度样品(1.5ng/ml)的
3、检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品,不适合低浓度样品的检测。结论:该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。关键词 乙肝表面抗原 ELISA 定量分析 方法学验证The reification of the HBsAg ELISA quantitative methodologyAbstractObject: to verify the quantitative methodology of Fuzhou blueprint biological engineering company to make sure whether it ca be used to th
4、e analysis of Clinical Sample. Methods: ELISA quantitative methodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8 ng/ml do 2 times diluted six concentration gradient to constitute a standard curve, testing With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately
5、precise and detection .Results: standard curve ,R2=0.997, the accuracy of RSD of 1.5ng/m is 16.78%,the RSD that cannot meet the demand of ng/ml basic level is less than 15% in common. The LOD is 0.172ng/ml, the testing of Low concentration samples (1.5ng/ml)are lower than high concentration samples
6、in both accuracy and precision , which as a result make it unsuitable for low concentration sample testing. Conclusion: the ELISA quantitative analysis kit of HBsAg cannot be used for the analysis of Clinical Sample.Key wordsHBsAg Quantitative analysis Verification Methodology. I前 言乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾
7、病之一,而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。随着免疫学技术的不断发展,抗原抗体检测灵敏度明显提高,使低水平乙肝病毒得以检出,对临床诊断及流行病学有重要意义1。ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点,可以在酶免疫分析仪上做批量检测。目前临床上多倾向于做定量分析,若想知道检验结果是否可靠,实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证,本实验对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行准确度,精密度和检测限等方法学验证,现报告如下。1. 材料与方法1.1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒,福州蓝图生物工程
8、有限公司出品。1.2 仪器酶标仪:Bio-Rad 680 ;洗板机:Bio-Rad 1575;超纯水系统:Millipore Elix ;电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司;振荡器(苏州管械,KJ-201A);移液器;Tip头;EP管。1.3 方法1.3.1溶液配置 1PBS缓冲液的配置: 称取8g NaCl、 0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中,用HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可。标准品的配置:原始标准品浓度为8 ng/ml。取6个2mlEP管,分别标记为S1-S6。50ul/wel
9、l, 共1孔需50ul,每孔配置60ul备用,按照下表稀释方案进行稀释。编号终浓度( ng/ml)预加1PBS取剩余(ul)标记(ul)S180标准品120S2460S16060S3260S26060S4160S36060S50.560S46060S60.2560S56060 质控品的配置:50ul/well, 共5复孔需250ul,配置300ul备用,取3个2mlEP管,分别标记为C1,C2,C3,按照下表稀释方案进行稀释。编号终浓度( ng/ml)预加1PBS取剩余(ul)标记(ul)C16150标准品450C23300C1300300C31.5300C23003001.3.2铺板方案 取
10、出试剂盒中已包被酶标板,取出板条,按照下表铺板方案进行铺板在相应孔中依次加入系列标准品、质控品及空白对照,每孔50ul。空白对照加入1PBS缓冲液。12345AS1C1C2C3PBSBS2C1C2C3PBSCS3C1C2C3DS4C1C2PBSES5C1C3PBSFS6C2C3PBS1.3.3加样步骤加入酶标抗体,50 ul/well,震荡。37电热恒温培养箱温育60min,取出后洗板4次, 加入A、B液, 50 ul/ well,37电热恒温培养箱温育15 min。加入终止液,50 ul/ well。酶标板放入酶标仪,盖上盖子,在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件,选
11、择450nm波长(参照波长630nm),设置LAYOUT和报告模式,测定各孔吸收值。2. 结果2.1 标准曲线与线性范围标准品理论浓度对应的实测OD值HBsAg(ng/ml)84210.50.25OD 1.661.000.620.390.310.27以HBsAg理论浓度为横坐标,所测OD值为纵坐标作图,绘制标准曲线观察线性关系,结果显示R2=0.9973,显示具有良好的相关性2.2 准确度(回收率)的验证 质控品理论稀释浓度对应实测浓度值HBsAg(ng/ml)测定值1234566.244.565.736.096.4033.363.293.553.283.481.51.241.271.171.
12、171.20质控品做了3个浓度梯度,每个浓度做了5个复孔,下表是对每个浓度梯度进行准确度(回收率)的验证。HBsAg(ng/ml)测定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率RR(%)3个浓度的平均回收率66.24103.9397.5897.07%4.5675.925.7395.576.09101.456.40106.6033.36112.13113.073.29109.573.55118.403.28109.403.48115.831.51.2482.4780.561.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93 结果显示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收率为97.58%,113.07%,满足限度要求在85%-115%的范围内,而HBsAg 1.5ng/ml的平均回收率为80.56%,满足方法定量限在80%-120%的范围内。3个浓度梯度的平均回收率为97.7%,显示准确性好。2.3精密度的验证2.3.1 板内精密度的验证HBsAg(ng/ml)测定值RSD(%)1234566.244.565.736.096.405.800.7412.7333.363.293.553.283.483.390.123.501.51.241.271.17