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1、重组质粒的连接、转化及筛选第一节概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段( 10kb)且结构简单,质粒要比其它 任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目 的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。但在实际工作中，如何区 分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源 DNA片段和载体DNA的浓度比例，可以将载体的自身环化限制在一定程度之下，也可以进一步采取一些特 殊的克隆策略，如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化，还可以利用遗传学
2、手段如a互补现象 等来鉴别重组子和非重组子。外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这 也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆 位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆 到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种 酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应
3、中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身 环化或几个分子串连形成寡聚物，而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种 DNA的浓度，以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5磷酸基团用碱性磷酸酯 酶去掉，最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载 体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于 平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DN
4、A及载体DNA 浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高 转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源 DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶 I的klenow大片段部分填平3凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5 a菌株。由于pBS上带有Ampr和lacZ 基因,故重组子的筛选采用Amp抗性
5、筛选与a -互补现象筛选相结合的方法。因pBS带有Ampr基因而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在 含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。pBS上带有B -半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和B -半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个 编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5a菌株带有 B -半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5 a编码的B -半乳糖苷酶的片段 都没有酶活性。但在pBS和DH5a
6、融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵 基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的B -半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫a -互 补。由a-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷)下存在下 被IPTG(异丙基硫代-B -D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会 导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去a -互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的 转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，a-互补产生的Lac+细菌由于含B-半 乳糖苷酶，
7、能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插 入后，失去a-互补能力，因而不产生B -半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将 重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为a -互补现象筛选。第二节材料、设备及试剂一、材料外源DNA片段：自行制备的带限制性末端的DNA溶液，浓度已知；载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ), 自行提取纯化，浓度已知；宿主菌:E. coli DH5 a，或 JM系列等具有a -互补能力的菌株。二、设备恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌， 工作台，微量移液枪
8、，eppendorf管。三、试剂1、连接反应缓冲液(10X)： 0.5mol/L Tris*Cl (pH7.6), 100mol/L MgCl2, 100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过 滤灭菌)，500 u g/ml牛血清清蛋白(组分V.Sigma产品)(可用可不用)，10mol/L ATP (过滤灭菌)。2、T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。3、X-gal储液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液，包以铝箔或黑纸以防止 受光照被破坏，储存于-20C。4、IPTG储液(200mg/ml):在800 u l蒸馏水中溶解200m
9、g IPTG后，用蒸馏水定容至1ml,用0.22 u m滤 膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20C。5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全浴解, 高压灭菌，待冷至60C左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml,然后摇匀后涂板。6、含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50卩g/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal储 液和4 ulIPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37C下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。7、感受态细胞制备试剂：见第三章。8、煮沸法快速分离质粒试剂：
10、见第一章。9、质粒酶及电泳试剂：见第二章。第三节操作步骤一、连接反应1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管，编号。2、将0.1 ug载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。3、加蒸馏水至体积为8ul，于45 C保温5分钟，以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0C。4、加入10XT4 DNA ligase buffer 1ul, T4 DNA ligase 0.5卩l,混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底, 于16C保温8-24小时。同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质 粒载体。二、E. coli
11、 DH5 a感受态细胞的制备及转化每组连接反应混和物各取2ul转化E. coli DH5 a感受态细胞。具体方法见第三章。三、重组质粒的筛选1、每组连接反应转化原液取100 ul用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37C下培养半小时以上，直至 液体被完全吸收。2、倒置平板于37C继续培养12-16小时，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。3、放于4C数小时，使显色完全(此步麦康凯培养基不做)。不带有pBS质粒DNA的细胞，由于无Amp抗性，不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有pBS载体 的转化子由于具有B -半乳糖苷酶活性，在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal和ITPG培
12、养基上 为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了 B-半乳糖苷酶活性，在麦康凯选择性培养基和x-gal和ITPG 培养基上均为白色菌落。四、酶切鉴定重组质粒用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50 u g/ml的5ml LB液体培养基中,37C下振荡培养12小时。 使用煮沸法快速分离质粒DNA直接电泳，同时以煮沸法抽提的pBS质粒做对照，有插入片段的重组质粒 电泳时迁移率较pBS慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选 重组质粒。注意1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端 酶量的10-100倍。2、在连
13、接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入 DNA 浓度至 100-200mg/ml。3、连接反应后，反应液在0C储存数天，-80C储存2个月，但是在-20C冰冻保存将会降低转化效率。4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37C，在连 接粘性末端时，反应温度以10-16C为好，平齐末端则以15-20C为好。5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段(2-5倍)，这将 有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。6、麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生
14、素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而 携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑 取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。7、X-gal 是 5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶 (b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。8、在含有X-gal和IPTG的筛选培养基
15、上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的 重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37C培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双 链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割 位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的 DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘 端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50u l体积1
16、小时内完全切开1 ug入噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件， 甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10X、5 X）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20ul体积反应体系如下：DNA10 X酶切 buffer 限制性内切酶 加 ddH O20.2-1 ug2.0 ul1-2 u （单位） 至 20 ul限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适
