《细菌的耐药性及检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细菌的耐药性及检测（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、细菌的耐药性及检测：体外抗生素敏感试验方法近年来，由于细菌耐药性不断增加，新的耐药机制和耐药菌株不断被发现，如 MRSA、 耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐青霉素肺炎链球菌(PRP)以及B内酰胺酶中的超广谱B内酰胺酶 (ESBLs)、去阻遏持续高产AmpC酶和金属B内酰胺酶等。临床抗生素的选择使用非常困难。 因此必须开展体外抗生素敏感试验，了解细菌耐药谱，对抗菌药物的临床使用效果进行预测， 对患者选择个体化的治疗方案；同时通过耐药检测及流行病学调查，为医院感染控制方案制 订提供依据；也有助于新药的抗菌特性研究。临床细菌学实验室应选择合适的抗菌药物用于 体外药敏试验，为临床抗感染治疗提供依据。(一
2、) 药敏试验中抗菌药物的选择原则抗菌药物药敏试验中测试药物种类的选择，应依据各医院院内感染控制委员会、临床医 师、药剂人员及微生物学检验医师等相互协商按本单位的实际情况制订，但必须满足以下条 件：1. 选用的抗菌药物应具备一组或一群代表性及预示性，如具有共同的耐药机制，或对某 类菌株具有特定的意义等。2. 有助于指导临床抗感染治疗与流行病学的调查。3. 应充分考虑分离菌株的来源部位，如从脑脊液分离的菌株，应选用能通过血脑屏障的 抗菌药物进行体外药敏试验等。4. 根据细菌种类或来源，通常选择616种不同抗菌药物。(二) 选择方案在遵循上述原则基础上，可以参照美国CLSI推荐的各菌种抗菌药物的分组
3、选择。结合 本院实际情况制定选用方案。1. 肠杆菌科细菌抗菌药物药敏试验抗菌药物选择方案(1) 首选试验和报告的抗菌药物：氨苄西林、氨苄西林舒巴坦或阿奠西林克拉维酸 或哌拉西林他唑巴坦或替卡西林克拉维酸中任一种；头孢唑林或头孢噻吩、头孢呋辛或 头孢孟多、头孢西丁或头孢替坦、头孢噻肟或头孢他啶或头孢曲松或头孢哌酮中任选二种； 头孢吡肟或头孢匹罗；庆大霉素；环丙沙星或左氧氟沙星或培氟沙星任选12 种；亚胺培 南，复方新诺明。(2) 次选试验和报告的抗菌药物：呋喃妥因、氯霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、 氨曲南、奈替米星、四环素、诺氟沙星或氧氟沙星。(3) 从肠道标本中分离的沙门菌属与志贺菌属细
4、菌常规只应试验和报告氨苄西林、复方 新诺明及一种喹诺酮类抗菌药物；分离自肠道以外的沙门菌属菌株应试验和报告多种抗菌药 物的药敏试验与报告，包括氯霉素和三代头孢菌素。(4) 分离自脑脊液的肠杆菌科细菌，只需报告氨苄西林、头孢噻吩、头孢唑啉、庆大霉 素的药敏结果。(5) 采用合适的方法如双纸片法等检测ESBLs；对产ES-BLs细菌，不管实际药敏检测结果 如何，所有青霉素类、头孢菌素类和氨曲南的试验结果报告耐药。2. 铜绿假单胞菌和不动杆菌属等药敏试验抗菌药物选择方案(1) 首选试验和报告的抗菌药物：替卡西林或哌拉西林或美洛西林中的一种，头孢他啶、 头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南或美洛培南；
5、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素；环 丙沙星等。(2) 次选试验和报告的抗菌药物：羧苄西林、头孢噻肟或头孢曲松、奈替米星、氯霉素、 四环素、左氧氟沙星或诺氟沙星或氧氟沙星、复方新诺明等。(3) 除铜绿假单胞菌和不动杆菌可用纸片扩散法进行药敏试验，对其他非发酵菌应使用 稀释法进行药敏试验。3. 葡萄球菌属菌种药敏试验抗菌药物选择方案(1) 首选试验和报告的抗菌药物：青霉素G、苯唑西林、头抱噻吩或头抱唑啉；红霉素或 克拉霉素或阿齐霉素、克林霉素；万古霉素；复方新诺明。(2) 次选试验和报告的抗菌药物：氯霉素、环丙沙星或左氧氟沙星或氧氟沙星、庆大霉 素、四环素、利福平、呋哺妥因等。(3) 青霉素G敏感的
6、葡萄球菌对其他青霉素类、头抱菌素药物敏感；青霉素G耐药，苯 唑西林敏感菌株，对B内酰胺酶不稳定的青霉素类耐药，对B内酰胺酶稳定的青霉素类、B 内酰胺酶抑制剂复合制剂及头抱菌素类抗菌药物敏感;苯唑西林耐药的葡萄球菌对所有B内 酰胺类抗菌药物耐药。因此只要从青霉素g及苯唑西林药敏试验结果，即可推断B内酰胺 类抗菌药物的敏感性，不必对这类抗菌药物进行常规药敏试验。(4) 腐生葡萄球菌对苯唑西林的耐药表现不稳定，不能进行以上推导，应以每种抗菌药 物稀释法实际检测结果判定。4. 肠球菌属药敏试验抗菌药物选择方案(1) 首选试验和报告的抗菌药物：青霉素G或氨苄西林、万古霉素。(2) 次选试验和报告的抗菌药
7、物：庆大霉素 500、链霉素 2000、氯霉素、红霉素、四环 素、利福平、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因等。由于肠球菌天然对氨基糖苷类存在低度 耐药，因此在测定时必须使用高浓度药物测定，测定结果仅预示能否用常规剂量进行治疗。(3) 在体外检测肠球菌对头孢菌素娄、氨基糖苷类(除高水平耐药筛选外)、克林霉素、复 方新诺明可出现敏感，但临床治疗无效，应报告耐药。(4) 不产B内酰胺酶、青霉素G敏感的肠球菌，可预示氨苄西林、阿莫西林、氨苄西林 舒巴坦、阿莫西林克拉维酸、哌拉西林他唑巴坦敏感。来自血液、脑脊液的菌株应检 测B内酰胺酶。对严重肠球菌感染，如心内膜炎患者通常用青霉素或氨苄西林或用万古霉素 加
8、一种氨基糖苷类药物联合治疗。(5) 耐万古霉素肠球菌(VRE)可选用氯霉素、红霉素、四环素、利福平等抗菌药物作药敏 试验，或与感染科医师、临床药学帅等共同商定，并将检测结果报告临床。5. 除肺炎链球菌外其他链球菌属菌药敏试验抗菌药物选择方案(1) 首选试验和报告的抗菌药物：青霉素 G 或氨苄西林、红霉素、氯霉素、林可霉素、 万古霉素等。(2) 次选试验和报告的抗菌药物：头孢噻肟或头孢曲松、头孢吡肟、左氧氟沙星、氧氟 沙星等。(3) 血液和正常无菌部位的体液分离到草绿色链球菌，应检测青霉素 G 的最低抑菌浓度 (Minimalinhibitoryconcentration， MIC)。(4) 从
9、尿道分离到的此类细菌，不做红霉素、氯霉素和克林霉素的常规药敏报告。不需常规进行对用于治疗A群、B群链球菌的青霉素及其他B内酰胺类抗菌药物的敏 感试验。发现万古霉素耐药或中介的A群、B群链球菌菌株，应送参考实验室予以确认。(三) 体外抗菌药物敏感试验常用的检测方法 目前可用于细菌药敏检测的方法较多，常用的有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、 E-test 法和自动化仪器法等。根据实验室条件和需要选用不同方法。1. 稀释法 有肉汤稀释法和琼脂稀释法。适用于需氧及兼性厌氧的快速生长型细菌，如 肠杆菌科、非发酵菌、葡萄球菌属和肠球菌属；嗜血杆菌属、奈瑟菌属、肺炎链球菌及其他 链球菌等菌株，还适用于厌
10、氧菌、酵母样真菌及支原体等。操作步骤如下：(1) 抗菌药物的稀释：根据每种药物、细菌种类和感染部位的不同，选择不同的抗生素 浓度稀释范围，用阳离子调节的M-H肉汤以2n进行倍比稀释抗菌药物(如256、128、64、 0.125)。将稀释后的药物加人试验管，或加入冷却至4555CM-H琼脂培养基中，立即 按无菌要求倾注至无菌平皿。(2) 菌液配制：用无菌生理盐水或M-H肉汤配制成0.5麦氏单位浊度的菌悬液。(3) 接种：在配制好的含药浓度梯度肉汤管中加入上述菌悬液，使其终浓度为 105cfu ml；如果用琼脂稀释法则调节菌悬液为浊度104cfu/ml,采用点种方式接种。(4) 结果观察：1) 最
11、低抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration.MIC)的判读：肉汤稀释法：抑制 细菌生长的最低药物浓度为MIC。按受试菌的生长条件，将上述接种好的试验管或平板置 35C及适当的环境中培养1624小时后观察结果。肉眼观察无细菌生长试验管的最低药物 浓度，为该抗菌药物的MIC。琼脂稀释法：无菌生长的含药平板的最低药物浓度为MIC。 一般比肉汤稀释法高1个稀释度。2) 最低杀菌浓度(Minimalbactericidalconcentration.MBC)的判读：MBC表示抗菌药物 杀灭 99.9或以上受试菌所需的最低浓度。将高于 MIC13 个稀释度的培养液转种于相应
12、的平板上，在合适条件下35C培养1824小时，杀灭99.9%或以上受试菌所需的最低浓度 为最低杀菌浓度(MBC)。(5) 结果报告：根据测定的 MlC 值，与相应抗生素的平均血药浓度或组织浓度比较。如 MIC值：血药浓度W23，则报告敏感；MIC值三血药浓度则报告耐药；两者之间为中介。2纸片扩散法(K-B法)适用于需氧及兼性厌氧的快速生长型细菌，如肠杆菌科细菌、非发 酵菌、葡萄球菌和肠球菌；进行改良后可用于苛养菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌 及其他链球菌等的检测。操作步骤如下：(1) 培养基：M-H琼脂培养基。厚度为4mm，pH7.27.4。(2) 培养物制备:直接菌悬液法:取纯培养物直
13、接悬浮于无菌盐水或M-H肉汤培养基， 调节悬液浊度至0.5麦氏单位(1.5X108cfu / mL)；肉汤增菌法:取纯培养物接种M-H肉汤， 35C培养46小时，使浊度达到0.5麦氏单位，可用无菌生理盐水或M-H肉汤调节。(3) 接种：用无菌棉签浸入上述菌悬液中，取出时将多余的菌悬液在管壁上挤出，均匀 涂布整个平板表面，置室温 35 分钟。(4) 贴药敏纸片：用无菌镊子或分配器将根据要求选定的含药纸片贴于平板表面，使纸 片完全与培养基表面接触，每两个纸片间的中心距离不少于24mm。通常直径为90mm的平 板可贴47张纸片。置35C孵育1624小时。(5) 抑菌环直径测量：以肉眼观察没有明显菌苔
14、生长的边缘为界，用最小量度为mm的 卡尺量取抑菌环直径。变形杆菌在抑菌环内生长的薄菌苔可忽略不计。复方新诺明抑菌环内 会有轻微细菌生长，小于20%左右可忽略不计。(6) 结果报告：根据每种细菌和每种药物之间的 MIC 和抑菌环直径之间的相关关系，抑 菌环直径的大小可以反应MIC值的高低。因此根据抑菌环直径的大小可以参照稀释法MIC 值的判断标准报告敏感、耐药和中介。每种细菌和每种药物之间判断标准范围可以参考美国 CLSI 解释标准。3.体外抗菌药物联合敏感试验 通常单种细菌的感染用一种抗生素可以控制。但在以下 一些情况需要联合使用抗生素：严重感染(如急性心内膜炎、败血症、腹腔脓肿及脑脓肿等)；
15、 病原菌不明确或单一药物疗效不佳；由多重耐药菌株引起的全身感染；中枢神经系统等感染 部位药物不易渗八；长期用药可能产生耐药性的感染疾病，如结核病和慢性骨髓炎等；混合 感染。此时需要进行抗菌药物的联合敏感试验。抗菌药物联合试验的结果将出现以下的结果：协同作用：表示两种药物药效可大干单 个药物使用的总和；累加作用：表示两种药物联合应用后药效等于两个药物各自单独使用 时的总和；无关作用：表示两种药物联合应用的药效等于活性最大的药物的药效；拮抗 作用：表示两种药物联合应用的药效小于奠中活性最大的药物的药效。根据抗菌药物作用机制可分为杀菌剂和抑菌剂，按其作用的速度又可分为快效和慢效， 将不同作用机制的药
16、物联合使用会产生不同的抗菌效果。杀菌剂之间联合使用可增强抗菌 作用或延迟耐药性出现，并可减少单一用药剂量，降低不良反应，是临床最常用的方法。如 B内酰胺类与氨基糖苷类药物的联合；多粘菌素与B内酰胺类或氨基糖苷类的联合；快效 杀菌剂与快效抑菌剂的联合用药常可导致相互拮抗作用，如B内酰胺类药物与四环素类抗菌 药物，大环内酯类与林可霉素类或氯氨苯醇类抗菌药物的联用等；慢效杀菌剂和快效抑菌 剂联合用药可起到累加或协同的作用，如多粘菌素或氨基糖苷类药物与四环素或大环内酯类 或林可霉素的联合应用；快效杀菌剂和慢效抑菌剂联用往往无增效作用，如B内酰胺类抗 菌药物和磺胺药物的联用。联合药敏试验的方法有：(1) 纸片扩散法联合药敏试验：选择2 种相关药物纸片贴于已涂布受试菌的药敏平板， 2 纸片中心间距
