《食品添加剂乳铁蛋白的质量规格要求生产使用工艺和检验方法食品中该添加剂的检验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《食品添加剂乳铁蛋白的质量规格要求生产使用工艺和检验方法食品中该添加剂的检验（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、资料四乳铁蛋白食品添加剂的质量规格要求、生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法或相关情况说明内蒙古伊利实业集团股份有限公司、乳铁蛋白质量规格要求一）感官指标项目标准检测方法色泽淡粉红色粉末。取5克被测样品置于一洁净 的白色搪瓷皿中，在自然光 线下用肉眼观察其色泽和 外观形态及其滋气味。滋气味具本产品特有的味道，无异味组织状态均匀、细密粉末，无吸潮、无结块。 正常视力卜尢可见杂质。二）理化指标项目标准检测方法总蛋白质三 95.0GB 5009.5-2010乳铁蛋白占总蛋 白的比例三90%见本节“二、检验方法”水分8.00GB 5009.3-2010灰分5.00GB 5009.4-201
2、0铁饱和度5-20%见本节“二、检验方法”pH4.5-6.8检测2%水溶液在20 C下的pH颗粒度要求40目筛分通过率285%标准师检测50目筛分通过率250%溶解度完全溶解，无肉眼溶物取0.2克乳粉，置于50C、200 mL水中，充分搅拌2分钟以上， 静止后观察。三）微生物、污染物及真菌毒素指标项目标准检测方法菌落总数（cfu/g）1000GB 4789.2-2010大肠菌群（cfu/g）10GB 4789.3-2010平板计数法金黄色匍萄球菌（cfu/g）10GB 4789.10-2010平板计数法酵母和霉菌（cfu/g）50GB 4789.15-2010阪崎肠杆菌（cfu/g）0/100
3、gGB 4789.40-2010沙门氏菌（cfu/g）0/25gGB 4789.4-2010铅（mg/kg）0.15GB 5009.12-2010砷（mg/kg）0.2GB/T 5009.11-2003黄曲霉毒素M（卩g/kg）0.5GB 5009.24-2010二、检验方法一）用反相高效液相层析法测定乳铁蛋白的纯度1. 样品准备对粉状乳铁蛋白，称出 20 mg 乳铁蛋白样品，用 MilliQ 水配成 20 mL，1 mg/mL的乳铁蛋白溶液，再通过0.2 pm的乙酸纤维素膜进行过滤。2. 材料和试剂(1)MilliQ 水(超纯水 18 megohm resistivity)(2) 95%的乙
4、腈(氰化甲烷)(HPLC级)(3) 1%的三氟乙酸(TFA)2.1 缓冲液准备( 1 )缓冲液 A：100% MilliQ 水把 1 L MilliQ 水装在 1 L 的 SCHOTT 瓶中。(2) 缓冲液B： 95%的乙腈分别量取 50 mL MilliQ 水和 950ml 乙腈。把二者混合，通过 0.45 pm 的滤 膜进行过滤。储存在 1 L 的 SCHOTT 瓶中。(3) 缓冲液 C： 1%的三氟乙酸用移液管量取 25 mL 三氟乙酸放入 200 mL MilliQ 水中，用 MilliQ 水补至250 mL。转移到250 mL的SCHOTT瓶中储存。3. 仪器设备( 1 )水基线体系
5、控制和获得数据的设备( Empower)(2) 水2695分离组件和2487双九吸收检测器(3) 反相高效液相层析柱-Alltech prosphere C4 300A 150mm x 4.6mm, with Alltech All-guard Guard 7.5 x 4.6mm.4. 高效液相层析的测量方法4.1 注射体积50 yL已过滤的乳铁蛋白样品或空白液注入柱中供分析。4.2 梯度表时间（min）流速(mL/min)成分曲线% A% B% C0.001.073.316.71010.001.0355510611.001.0187210613.001.0187210615.001.073.
6、316.71064.3 温度柱子温度=35C样品温度=10C4.4 检测在波长280 nm处检测乳铁蛋白，乳铁蛋白的洗脱时间大约9.7分钟。5. 过程与计算5.1用Empower软件，用样品的层析谱减去空白溶液。5.2 结合整个样品的层析谱，算出全部蛋白的含量。然后结合乳铁蛋白的高峰区 算出乳铁蛋白的百含量（以蛋白质为基数）。5.3 用下面的计算公式计算乳铁蛋白的百分含量（干重）：乳铁蛋白的百分含量（干重）=蛋白含量/（100 -水分）x乳铁蛋白的百分含量 其中：蛋白含量是用凯氏定氮法测定的蛋白含量 乳铁蛋白的百分含量是用高效液相层析法测定的乳铁蛋白含量（二）乳铁蛋白铁饱和度的测定1. 原理通
7、过向乳铁蛋白水溶液中逐渐加入等分量的三价铁离子溶液直至乳铁蛋白 铁饱和。该过程中乳铁蛋白铁饱和度的变化在465 nm分光光度计下进行检测，当 吸光值不再变化的时候说明乳铁蛋白已经完全饱和。2. 试剂2.1 FeCl3.6H2O2.2 NTA （氨三乙酸）2.3 NaH2PO4.H2O2.4 Na2HPO4.12H2O2.5 NaHCO32.6 NaOH2.7 NaCl3. 溶液的配置3.1配置含有10 mM氯化铁和0.1 M HC1的溶液：（1）在100 mL容量瓶中分别加入：-0.83 mL 37% 的 HC1-0.270 g 的 FeCl3.6H2O （准确称量）（2）加蒸馏水至100 m
8、L刻度处3.2 配置40 mM Na-NTA溶液：在100 mL容量瓶中分别加入：-0.764 g 的 NTA-加入大约20 mL去离子水-缓慢加入1 M的NaOH溶液来溶解NTA粉末（以形成可溶的NTA钠盐）-将1M的NaOH逐滴加入，每加入一滴并充分混合直至NTA完全溶解3.3 配置含有5mM FeCl3.6H2O和20 mM NaNTA的溶液-将等量（各20 mL）的3.1和3.2溶液混合-用10 M的NaOH溶液将溶液的pH值调至4-6之间（例如：4.5），但要注意 尽可能少的将溶液稀释）3.4 0.1M NaHCO3 的配置将8.401 g的N aHCO3加入1升蒸馏水中。3.5 2
9、%乳铁蛋白水溶液的配置-将0.8 g乳铁蛋白粉末溶解于40 mL蒸馏水中- 搅动直至完全溶解4. 铁饱和度的测量可以用所配置溶液来测定pH值和在600 nm时的透光率，溶液必须经过0.45 pm millipore过滤器过滤-将1mL乳铁蛋白溶液注入比色皿-加入 1.5 mL 0.15M NaCl和200 pL的0.1 M的NaHCO3溶液-在465 nm下测量溶液的吸光值-加入10 pL等量的溶液3.3。每加一次，充分混合并在465 nm下测量吸光值, 直到吸光值变为恒定，也就是说乳铁蛋白趋于饱和。5. 结果的表达以纵坐标为吸光值，横坐标为等量三价铁离子浓度作图。直线 (1)为当乳铁 蛋白趋
10、于饱和时的吸光值。直线(2)为以初始乳铁蛋白吸光值为原点到铁饱和时 吸光值的连线。将直线(2)反向延长使其与横坐标交汇。OD at 4C51HUAiiquc-t ofFeCB-NIA乳铁蛋白初始铁饱和度可以通过以下两种方法计算得出：（1）通过465 nm下最初的吸光值（bl）与饱和时溶液的吸光值（b2）的比值计算 得出：b1乳铁蛋白铁饱和度（） =xlOOb2（2）通过初始乳铁蛋白中三价铁离子的微摩尔数（al）和饱和乳铁蛋白中三 价铁离子的微摩尔数（a）的比值得出：a1乳铁蛋白铁饱和度（）= x100a备注：一等份也就是每10 yL的三价铁离子溶液=0.05 ymol Fe3+6. 乳铁蛋白浓
11、度测定考虑到1 mol的乳铁蛋白可以结合2摩尔的三价铁离子，因此溶液中乳铁蛋白 的摩尔数应该是铁离子摩尔数的二分之一。ymol 乳铁蛋白=0.5xymol Fe3+乳铁蛋白分子量= 77,000因此，77,000xymol乳铁蛋白x10-6=检测溶液中乳铁蛋白的质量（g）。（三）乳制品中乳铁蛋白含量的检测第一部分 高效毛细管电泳测定乳制品中乳铁蛋白含量A.1 适用范围 本方法适用于乳粉和乳铁蛋白原料中乳铁蛋白的定性和定量分析。A.2 原理 试样经处理后进入毛细管中，在毛细管中充入缓冲溶液，两端加高电压，毛 细管中形成电场。样品中带电粒子在电场中以不同速度运动，流经检测器被检测， 得到分离谱图，
12、根据峰面积和浓度成正比的关系，计算不同成分的含量。A.3 试剂A.3.1 实验配制所用水均为超纯水。A.3.2乳铁蛋白标准品（Fluka）。A.3.3氢氧化钠：1 moL/L溶液。A.3.4 硼酸（sigma）。A.3.5 CsOH（50 %水溶液，北京百灵威化学技术有限公司）。A.3.6 冰乙酸（优级纯）。A.3.7 十二烷基硫酸钠（SDS, Sigma-Aldrieh，货号:L3771）。A.3.8 羟乙基纤维素（HEC, Sigma-Aldrieh，货号:54290）。A.3.9 HEC储备液的配制：HEC是一种淡黄色粉末状固体，首先准确量取100 mL超纯水置于试剂瓶中，将其放置在60
13、 C水浴中加热，将准确称量的4 g HEC 逐步加入，涡旋混匀，待其完全溶解即配制成40 g/L的HEC储备液，放入4 C冰 箱备用。A.3.10运行缓冲液：0.3 moL/L硼酸，其中含20 mmoL/L SDS和8 g/L HEC。首先 分别准确称取1.855 g硼酸和0.577 g SDS放入100 mL容量瓶中，加入70 mL的超纯 水，超声使其溶解，然后再加入20 mL质量浓度为40 g/LHEC储备液，涡旋混匀 后用1 moL/L的CSOH调节pH值到8.80，最后用超纯水定容到刻度线，室温放置 备用。A.3.11样品缓冲液：0. 05 moL /L HAC。准确移取1.437 m
14、L冰醋酸置于500 mL 容量瓶中，用超纯水定容到刻度，放入4 C冰箱备用。A.4 仪器A.4.1 毛细管电泳仪（带有紫外检测器）。A.4.2 电子天平。A.4.3 pH 计。A.4.4 超声振荡器。A.4.5 高速离心机A.5 操作步骤A.5.1 样品的前处理分别称取一定质量的的样品于10 mL容量瓶中，加入适量样品缓冲液，涡旋 混匀后，再用样品介质稀释定容到刻度，于9000 r/min离心10 min，取上清液分 析。A.5.2 测定A.5.2.1 标准曲线的绘制准确称取10 mg乳铁蛋白标准品于l mL样品管中，加入1.5 mL样品介质涡旋 混匀后，制得10000 mg/L的乳铁蛋白标准储备液，放入4 C冰箱备用。工作液由储备液经0. 05 mol/L HAc 稀释后制得。准确移取10、20、40、80、160 mg/L质量浓度为5000 mg/L的Lf标准储备液 于1 mL样品管中，再分别加入990、980、960、920、840 mg/L样品缓冲液，混匀 后即得50、100、200、400、800mg/L的工作液。峰面积（A）与质量浓度（C, mg/L）在50800 mg/L范围内具有良好线性关系， 检出限（LOD）为15 mg/L。A.5.2.2 试样测定测定条件毛细管（50 umx57 cm，有效长度:50 cm,河北永年
