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1、柠檬酸高产菌株的选育222011331012052 刘亚超 2011级生物技术关键词：黑曲霉、T21紫外诱变、发酵摘要：黑曲霉作为柠檬酸的产生菌，来进行相关的实验内容。为了进一步提高柠檬酸生严菌种对糖的转化效率和产酸速率，有很多方法，比如改善黑曲霉生长的温度、pH、溶氧量、限制金属离子等培养条件，同时也可以对黑曲霉进行诱变处理。目前国内柠檬酸菌种选育，物理诱变常选用紫外、60Co-射线等，化学诱变多选用DES及亚硝基胍等3。本次实验设计除了优化黑曲霉产柠檬酸的培养条件之外，还要将黑曲霉菌种进行紫外诱变处理。引言：柠檬酸的用途很多，比如用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也
2、是化学中间体。柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。所以可以起抗凝血作用。柠檬酸也有保健的作用，比如柠檬酸能够帮助机体彻底排出血液中毒素。所以筛选出优质的高产柠檬酸菌株，有很重要的意义。1.材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种 以实验室平板上已有的黑曲霉(Aspergiltus niger)为出发菌株（经多次平板划线分离纯化所得），制备种子液，将发酵好的种子液按液体发酵培养基体积的10接入已灭菌的发酵培养基中，于30左右在200250rpm培养45d。1.1.2 培养基 分离菌种培养基为PDA培养基，初筛培养基为2淀粉查氏培养基，发
3、酵培养基为废弃苹果榨汁培养基。 1.1.3 试剂及仪器3-5二硝基水杨酸、结晶酚、酒石酸钾钠、722型紫外分光光度计，组织捣粹机等。1.2 方法1.2.1 菌株的分离纯化 用黑曲霉出发菌株，通过平板划线分离的方法进行分离纯化，培养三批，得到纯化的黑曲霉单菌落。1.2.2 初筛 用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数成不同的梯度，制成孢子悬液。取各个不同梯度的孢子悬液1 mL注人2淀粉查氏培养基平板中涂布，28，培养3 d后，向培养基中滴人I2-KI试剂，测量菌落产生的透明圈大小并记录下数据。1.2.3 复筛 将初筛所得透明圈较大的菌
4、株接入废弃苹果榨汁培养基中进行培养，待发酵一段时间后，通过检测发酵液中的总糖、还原糖和柠檬酸的产量的量进一步筛选高产柠檬酸的黑曲霉菌株。柠檬酸含量检测采用GBT82691998中柠檬酸的检测方法4。总糖和还原糖的检测用3-5二硝基水杨酸法5。1.2.4 黑曲霉的诱变 对初筛复筛后所得的高产菌株进行了T21紫外诱变。操作过程为：取筛选的菌种的斜面，加入无菌水约23 mL洗下孢子并加入100 mL无菌水带玻璃珠的三角瓶中打散孢子，4层纱布过滤，获得孢子悬液，调整孢子浓度至约35个mL，取l mL涂布查氏培养基平板，置紫外箱中，照射45 s，然后置30培养箱中培养67 d。从平板上挑取菌落最大的菌株
5、采取复筛时的的方法做发酵柠檬酸的检测6。1.2.5 高产菌株的培养 经上面的方法得到高产菌株后，将之接种到平板培养基上多培养几代，再测定柠檬酸产量，可以测出菌株有没有衰退或出现回复突变。并且通过测定比较可以看出哪个诱变后的菌株综合各方面来讲生产能力较好。这样就能得到高产的黑曲霉菌株了。2.黑曲霉的最适发酵条件用原来分离纯化得到的菌株参照理论上的最适合的发酵条件进行调整，在不同的发酵条件下进行培养，用以找到适合的发酵条件。 影响黑曲霉发酵的因素有：温度、pH、培养时间等等因素，都要考虑进去。3.实验方案中可能会有的问题及解决方法可能没有现成的废弃苹果榨汁培养基，我们可以查找相关文献，看有没有方法
6、可以自己配制。 在进行紫外诱变时可能致死率过高或过低，致死率过高菌株存活量太小，致死率低的话突变的菌株数目也会变小。所以可以先进行第一次突变培养，若致死率不合适可以调整紫外诱变的时间来重新诱变培养。 黑曲霉最适发酵条件的确定中相关因素过多，要完整地测一遍费时费力，比较难以完成。所以可以通过设定正交实验来完成，这样要测的数据量就大大减少了。参考文献:1 Meyrath J. Process Biochem, 1967, 2(October): 25.2 陈陶声等. 有机酸发酵生产技术. 北京：化学工业出版社，1991：31.3 洪厚胜,刘辰,薛业敏等. 激光复合诱变选育木薯原料柠檬酸高产菌J.食
7、品与发酵工业. 2003, 29 (1).4 中华人民共和国国家标准. 柠檬酸的检测方法P. 中国专利: GBT8269, 19985 张龙祥, 张庭芳. 生化实验方法和技术M. 北京: 人民教育出版社, 1982. 3-5.6 刘丽, 刘谨, 仇润祥等. 丝状真菌表达分泌系统中受体菌的构建J. 生物工程学报, 2002, 18(6): 667-6707 赵琴, 李红, 魏婷婷等. 柠檬酸高产黑曲霉菌株选育与发酵新底物研究J.重庆师范大学学报(自然科学版), 2008, 25(1): 79-82.8复旦大学遗传研究所、微生物教研组和上海新型发酵场；微生物学报；13；198；19739宇佐美昭次，日化学与工业杂志，17；727；196410高山健一郎；日本公开特许，77105285,197711高山健一郎，日本公开特许，74118890,1974
