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1、分子机制研究套路（九）组蛋白（去）乙酰化课题：组蛋白乙酰转移酶A在B基因转录调控中的作用1概念介绍： 表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门 遗传学分支学科。表观遗传的现象很多主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。染色质的基本组成单位是核小体，核小体是由146bp碱基对缠绕由H2A、H2B、H3、H4各 2个组成的组蛋白八聚体构成的，各个核小体之间由H1连接，最终组成染色质。组蛋白修饰指对组蛋白N端尾部氨基酸的修饰，包括乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等。 在组蛋白的各种修饰方式中，组蛋白乙酰化的研究较为透彻。组蛋白的乙酰化主要发生在赖 氨酸残
2、基上，赖氨酸侧链含有氨基，在生理条件下带正电荷，从而能够和含有磷酸基团的DNA 紧密结合，被乙酰化后使得正电荷被中和，无法和 DNA 紧密结合使得染色质结构松散/促进基因的表达。组蛋白的乙酰化动态平衡由大量不同的组蛋白去乙酰转移醺HDAC） 和组蛋白乙酰化酶（HAT）调节。如前所述，组蛋白的乙酰化能够促进某些基因的激活，因 此通过使用HDAC抑制剂相对提高组蛋白乙酰化的程度，能够显著上调大量具有保护作用 的基因，达到治疗某些疾病的目的。目前临床使用的HDAC抑制剂包括丙戊酸（VPA）曲 古菌素A、丁酸苯酯等。早期，人们认为组蛋白修饰只是提供一个信号，指导与染色体功能相关的非组蛋白与染色体 的结
3、合。随着研究的深入，人们越来越清楚地认识到这些修饰的某种组合对转录调控具有极 其深刻的影响，“组蛋白修饰密码”假说诞生了。这个假说推测特定的组蛋白修饰是同一个 组蛋白或另一个组蛋白分子进一步修饰的决定因素，特定的共价修饰，修饰发生的顺序特征 以及各种修饰的组合模式形成了复杂的“组蛋白密码”，这种密码决定了基因的转录状态，这种密码会被调控染色体结构和基因转录的蛋白质解读。2示意图：Hhtcne acetylationH&AC inhrNcofVPA, bulyfdT TSA)图 1 ：组蛋白乙酰化的动态调节过程图 2 ：核心组蛋白八聚体的结构和组蛋白尾部可能的共价修饰3研究思路：3.1HDAC抑
4、制剂使B基因mRNA上调，且使B基因启动子组蛋白H4乙酰化水平升高.33.2组蛋白乙酰转移酶A过表达增强B基因启动子的转录活性33.3B基因启动子上有A蛋白的结合,过表达A蛋白能升高细胞内源性B基因mRNA水平.43.4B基因启动子上的两个Sp1结合位点被确认.43.5乙酰转移酶A和转录因子GATA-1协同激活B基因启动子转录，B基因启动子上两个GATA-1位点对于A的功能是必要的53.6乙酰转移酶A与转录因子GATA-1和Sp1协同增强B基因启动子的转录活性73.1HDAC抑制剂使B基因mRNA上调，且使B基因启动子组蛋白H4乙酰化水平升高为弄清楚组蛋白乙酰化是否与B基因的转录调控有关，用H
5、DAC抑制剂丁酸钠aBu和TSA 处理cell-1细胞培养24h后进行RT-PCR分析。结果显示HDAC抑制剂可使B基因mRNA 水平升高。由于 HDAC 抑制剂是通过诱导基因启动子组蛋白高乙酰化而影响基因表达的，因此，接下 来考察HDAC抑制剂对B基因的上调是否也是通过升高B基因启动子组蛋白乙酰化水平实 现的。通过染色质免疫共沉淀（CHIP）实验，结果如预期所料，HDAC抑制剂处理细胞后， B基因mRNA转录上调的同时，伴随着B基因启动子组蛋白H4乙酰化水平的明显升高。32组蛋白乙酰转移酶A过表达増强B基因启动子的转录活性既然 B 基因的表达与 B 基因启动子组蛋白乙酰化修饰有关，那么，到底
6、是何种组蛋白乙酰 转移酶与 B 基因启动子的功能直接相关呢？经过文献调查，我们推测可能是组蛋白乙酰转 移酶A。为了探讨组蛋白乙酰转移酶A在B基因转录中的作用，需构建B基因启动子的报 告基因质粒PGL3-E-BP（B基因promoter）。将从人类基因组克隆出来的B基因启动子片段插 入萤火虫荧光素酶报告基因载体 PGL3-Enhancer。将不同量的组蛋白乙酰转移酶A表达质粒（0、0.5、1、2、3、4 pg）与1 pg报告基因质 粒 PGL3-E-BP 瞬时转染 293T 细胞，培养 24 h 后，裂解细胞，测定相对荧光素酶活性。结 果显示：组蛋白乙酰转移酶A能够以剂量依赖性的方式增强B基因启
7、动子的转录活性。 接下来，将PGL3-E-BP、组蛋白乙酰转移酶A表达质粒和腺病毒癌蛋白E1A的表达质粒共 转染293T细胞。已知E1A能够与组蛋白乙酰转移酶A的HAT区结合从而抑制A的HAT 活性。结果显示： E1A 确实抑制了组蛋白乙酰转移酶 A 对 B 基因启动子的激活功能。当以 E1A3-36 （缺失与A结合的结构域）代替E1A时,A的作用不受影响，证明了 A在激活B 基因启动子的过程中，它的乙酰转移酶活性是必需的。AHAT与报告基因质粒共转染时， 对B基因启动子的转录激活作用显著减弱，更进一步明确了A的乙酰转移酶活性在B基因 启动子的转录激活中是必不可少的。注释：1 ）此步骤中关于组
8、蛋白乙酰转移酶A的推断，需根据文献调研或选择不止一个可能 候选者，进行逐一排查，但实验方法同上。2 ）关于腺病毒癌蛋白E1A，根据组蛋白乙酰转移酶A的不同，可能会有所变化，如 果无法找到可与组蛋白乙酰转移酶A的HAT区结合从而抑制A的HAT活性的蛋白，则此 部分可省略。3.3B基因启动子上有A蛋白的结合,过表达A蛋白能升高细胞内源性B基因mRNA水平 前面已证实A蛋白对B基因启动子报告基因的激活作用，A蛋白是否对內源的B基因表达 也发挥作用，还需要进一步的实验来揭示。如果能发现A蛋白确实与B基因启动子结合， 那将是最直接的证据。染色质免疫沉淀（CHIP ）实验结果显示：在B基因启动子上确实有
9、乙酰转移酶A蛋白存在。在证实了 A蛋白确实能与B基因启动子结合后，接下来对A蛋白激活內源B基因转录的功 能进行进一步考察。用A蛋白表达质粒转染cell-1细胞，使A蛋白在cell-1细胞中过量表达， 提取细胞RNA，Real-time PCR分析细胞内B基因mRNA的水平，结果显示：A蛋白过表 达细胞中B基因的mRNA水平显著高于对照组，与HDAC抑制剂NaBu处理的结果相近。3.4B基因启动子上的两个Sp1结合位点被确认Sp1 是哺乳动物遍在表达的转录因子，参与大量基因的转录调控，它能与靶基因启动子区的 富含GC的元件相互作用，既能激活基因转录，又能抑制基因的转录究竟发挥哪种作用取 决于它结
10、合的元件及与之作用的辅因子。 在B基因启动子上游-164/-158和-146/-139有2个可能的Spl结合序列GGGAGGG，为弄清 Spl蛋白是否真的与这两个序列结合，通过电泳迁移率（EMSA）分析。首 先 体 外 合 成 了 包 含 上 述 两 段 序 列 的 寡 核 苷 酸 链 ， 野 生 型 ： 5-CCAGAGCTGGGGGAGGGGGTACACTAGAGGGAGGGGCTACTTTGG3 ；突变体： 5-ccagagctgggggAAAGggtacactagagggAAAggctactttgg3。以生物素标记 制备探针，将Sp1表达质粒转染293T细胞，培养24 h后提取核蛋白，
11、进行EMSA分析。结果显示：核提取物使含有 2 个可能 Sp1 位点的探针发生凝胶电泳迟滞现象；当实验体系 中再加入100 倍的未标记探针时，迟滞现象消失，竞争实验说明该迟滞现象确实是我们所研 究的探针与核蛋白结合产生的；那么，核提取物中与探针结合的蛋白究竟是不是Sp1呢？ 为回答这个问题，在实验体系中加入 Sp1 抗体，如预期所料，由于抗体的特异性结合使探 针-蛋白质复合物的质量增大，因此在电泳中发生了 super-shift现象；为了证实Sp1与探针 结合的位点确实是2个可能的Sp1位点，通过位点突变的探针代替野生型探针，再做EMSA 实验，结果无法观察到用野生型探针时所看到的迟滞带。以上
12、所有结果充分说明了 B 基因 启动子上这2个相近的元件在体外能与Sp1结合。注释：1 ）关于Sp1与B基因结合这部分，主要是为了后续发现做铺垫，如果课题不涉及， 可以省略这部分。但是，由于 Sp1 可能和很多基因的启动子结合，如果您在完成前期实验 后，不确定您兴趣基因的特异性转录因子，可以尝试SP1。2本部分对EMSA实验的设计和结果解释非常全面可作为EMSA实验参考的范例。3.5乙酰转移酶A和转录因子GATA-1协同激活B基因启动子转录，B基因启动子上两个 GATA-1位点对于A的功能是必要的作为转录辅激活因子，乙酰转移酶A必须由特定的转录因子招募到靶基因的启动子上才 能行使其功能。在B基因
13、启动子上有两个典型的转录因子GATA1的结合位点（-124bp和 -lOObp） , GATA1可能招募乙酰转移酶A到B基因启动子。为了验证这个假设我们将B基 因启动子报告基因PGL3-E-BP乙酰转移酶A （或AHAT）以及GATA1表达质粒共转染293T 细胞。相对荧光素酶活性测定结果显示：报告基因 PGL3-E-BP 单独与乙酰转移酶 A 或 GATA-1表达质粒共转染时，与对照相比，转录活性分别只增加了 1倍和1.5倍，当与乙酰 转移酶A和GATA1表达质粒共转染时，启动子的转录活性增加了近20倍，远远超过了二 者单独作用的加和，说明转录辅激活子乙酰转移酶A和转录因子GATA1在B基因
14、启动子 的激活中具有强烈的协同作用。另外，AHAT和GATA1共转染时，对启动子的激活作用 相当于二者单独作用的加和，所以GATA1介导的乙酰转移酶A对B基因转录的作用有赖 于乙酰转移酶A的HAT活性的，这些结果清晰地表明了乙酰转移酶A的HAT活性在B基 因转录中的重要作用，同时又一次证明了组蛋白（或转录因子）的乙酰化修饰参与了 B基因的 转录调控。上面的工作证实了 GATA-1介导了乙酰转移酶A在B基因转录中的作用。在B基因启动 子上有两个GATA1结合位点（-124bp和-1OObp），那么这两个位点中的哪一个参与了乙酰转 移酶 A 的功能，还是两个都需要。为此我们构建了三个启动子位点突变
15、体报告基因质粒 : PGL3-E-BPM1（-124bp 位点突变）PGL3-E-BPM2 （-100bp 位点突变）和 PGL3-E-BPM3 （-124bp 和-1OObp两个位点都突变）。然后将它们分别与GATA-1和乙酰转移酶A共转染，相对荧光 素酶活性分析结果显示，与野生型PGL3-E-BP相比，两个位点分别突变（PGL3-E-BPM1和 PGL3-E-BPM2）时，乙酰转移酶A和GATA-1对启动子的协同激活作用明显降低，当两个位 点都突变（PGL3-E-BPM3）时，乙酰转移酶A和GATA1对B基因启动子的协同作用不复存 在，由此可知两个 GATA-1 位点都参与了乙酰转移酶 A
16、 的招募，而且两个位点的作用是互 相促进的。接下来我们想知道， GATA-1 招募乙酰转移酶 A 激活 B 基因启动子转录是否与组蛋白乙酰化有关呢？通过报告基因染色质免疫沉淀(Reporter ChIP)实验，结果显示当乙酰转移酶A和 GATA-1表达载体与野生型报告基因(PGL3-E-BP )共转染细胞时，乙酰转移酶A在报告基 因启动子上的结合有明显的增加，启动子组蛋白H4的乙酰化水平同时也有明显的升高，然 而当把GATA1位点突变体报告基因PGL3-E-BPM3 (两个GATA1位点突变)、乙酰转移酶 A和GATA1表达载体共转染时，启动子组蛋白H4的乙酰化水平没有明显的变化，说明 GATA-1协同乙酰转移酶A确实能提高启动子处的组蛋白乙酰化水平从而促进B基因的转 录。3.6乙酰转移酶A与转录因子GATA-1和Sp1协同増强B基因启动子的转录活性 前面已证实
