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1、高效液相色谱法测定兔血浆中注射用纳米羟基喜树碱的浓度 陈渝军1, 易以木2(1.武汉市妇女儿童医疗保健中心，湖北武汉 430016；2.华中科技大学同济医学院药学院，湖北武汉 430030) 摘要目的：建立家兔血浆中注射用纳米羟基喜树碱含量的HPLC测定方法。方法：血浆样品酸化后，提取分析。色谱柱C18 （10 m， 250 mm4.6 mm ID），流动相为 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH4.0）-甲醇（50：50），流速1.0 mL/min，柱温30 ，检测波长384 nm。以5.0 mg/kg剂量给大白兔耳缘静脉推注纳米羟基喜树碱针，于不同时间点采血测定药物浓度。结果：羟基喜树碱
2、保留时间为8.7 min，定量线形范围为20-8000 ng/mL。血浆中羟基喜树碱的回收率为96.92%-103.51%，日内精密度 7.87%，日间精密度 11.55%。纳米羟基喜树碱注射后符合三室模型。结论：本法简便实用，定量准确，可满足纳米羟基喜树碱动力学研究的需要。关键词羟基喜树碱；纳米；高效液相色谱；血药浓度Determination the concentration of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits by HPLCCHEN Yu-Jun1, YI Yi-Mu2 (1. Wuhan medical
3、and health center for women and children, Hubei Wuhan, 430016; 2.School of pharmacy, Tongji medical college, Huazhong university of science and technology, Hubei Wuhan, 430030)Abstract Objective: To establish a HPLC method for the determination of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbi
4、ts. Methods: After acid treatment, plasma samples were injected and measured by abstraction. The Chromatographic column was C18(10 m， 250 mm4.6 mm ID). Methannol-10mmol/L phosphate buffer (pH4.0) (50:50) was served as mobile phase at 1.0 mL/min . Detection wavelength was 384 nm. Determination the co
5、ncentration of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits after iv. administration with the dosage of 5.0 mg/kg. Results: The retention time of hydroxycamptothecin was 8.7 min. A good linearity was shown in the concentration range of 20-8000 ng/mL. The recovery was between 96.92% and 103
6、.51%. The intra-day RSD was less than 7.87% and the inter-day RSD was less than 11.55%. The concentration-time curves of injected-nano-hydroxycamptothecin mainline conformed to three-compartment model. Conclusion: This method was simple, practical and accurate. It could be applied in pharmacokinetic
7、 study of nano-hydroxycamptothecin.Key words hydroxycamptothecin; nano; HPLC; drug concentration in plasma喜树碱(camptothecin,CPT)是从我国特有的珙垌科植物喜树的树千、树皮和果实中提取的一种具有抗肿瘤作用的生物碱，但由于毒性大而限制其临床应用。10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是喜树碱的半合成衍生物，体外和动物实验显示它比CPT的抗肿瘤作用强和抗瘤谱宽且毒性较低。纳米技术的出现，使保留内酯结构的HCPT进入体内成为可能，为充分发挥其抗
8、肿瘤活性带来希望。本研究将从HCPT纳米针静脉注射后在家兔血浆药物浓度随时间变化规律方面考察HCPT纳米针的药动学特性，评价其临床应用前景。1 仪器、试药与实验动物 11 仪器 Lab Alliance高效液相色谱仪（包括 Lab Alliance PC3000HPLCSystem和Model 500型UV检测器），色谱柱为Irregular-HC18柱（10 m，4.6 mm250 mm，天津市色谱科技有限公司提供），Heraeus高速离心机（德国），LDZ5-2型低速离心机（北京医用离心机厂），BRANSON 3510型超声振荡仪（美国）。12 药品、试剂与实验动物 HCPT内酯标准品（批
9、号：20020501，含量：98.6%）和HCPT注射用纳米针（批号：20030501，含量：97.0%）由武汉李时珍药业有限公司提供。甲醇和乙腈为色谱纯（天津市运盛化学试剂科技有限公司），磷酸和其它试剂均为分析纯（天津化学试剂三厂）。日本大耳兔，天津市动物中心提供（实验动物质量合格证号：WJ津实动质R-A准字第001号），雌雄兼用，体重2.53.0 kg。2 测定方法及条件 21 色谱条件：色谱柱C18 （10 m， 250 mm4.6 mm ID），流动相为 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH4.0）-甲醇（50：50），流速1.0 mL/min，检测波长384 nm，柱温30 。22
10、 血浆样品的采集 ：实验用家兔禁食12小时，于给药后按设计的时间点，经耳缘静脉取血2 mL，置于5 mL肝素化试管，3000 r/min离心10 min，取血浆，-20 冷冻保存。23 血浆样品的处理：精密量取0.5 mL血浆样品于2 mL离心管，加85%磷酸2 L，室温避光环合2小时以上。环合后的样品加乙腈1 mL，充分混匀，超声振荡5 min，13000 r/min离心10 min。取离心后上清液1.1 mL，置于10 mL离心管，50 水浴，氮气流吹干液体，残渣以80 L流动相溶解，20 L进样环进样。3 分析方法考察结果 31 方法专属性取家兔空白血浆，除不加标准品溶液外，其余按“血浆
11、样品处理”顶下方法处理并分析，获得空白血浆的色谱图，将一定浓度HCPT内酯标准溶掖加入空白血浆中，同法操作，获得相应的色谱图。血浆色谱图中HCPT保留时间为8.7 min，血浆中内源性物质不干扰HCPT的测定。A B 1 C 1A：空白家兔血浆样品；B：家兔空白血浆+HPCT标准品；C：HCPT给药后30 min家兔血浆样品；1：羟基喜树碱图1 HPLC法检测羟基喜树碱家兔血浆样品色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of HCPT in rabbit plasma32 标准曲线制备 取兔空白血浆300 L，加HCPT内酯标准品的系列标准溶液200 L，配制成HCPT含量为2
12、0，50，250，1000， 2000， 4000，8000 ng/mL的血浆样品。按“血浆样本的处理”项下操作，残渣以80 L流动相溶解进样。以HCPT标准血浆样品浓度为横坐标，色谱图的HCPT峰面积为纵坐标绘制低浓度标准曲线，取三条标准曲线的平均值（表1），采用加权最小二乘法计算直线回归方程为：Y0.003354X10.8895，r=0.9990（n=3）。表1.标准曲线数据（n=3）Tab.1 Results of HCPT of standard deviation (n=3)浓度（ng/mL）峰面积检测值平均峰面积SDRSD%123207846731370987419.0385.15
13、.195017263166001651216791.7410.52.4425085630811157920581983.33299.34.021000305336258445227308263696.339278.214.892000622120618728617460619436.0240.30.3940001241907120249011357991193399.063636.04.4980002472470264477321517872423010.0250187.010.3233 精密度试验按“标准曲线制备”项下方法配制低、中、高3个浓度的HCPT内酯血浆样品，每个浓度5个样本1日内连
14、续测定，根据标准曲线，计算样品的测得浓度、SD和RSD%；同法配制3个浓度的HCPT内酯血浆样品，连续测定5天，每天连续测定2次，根据标准曲线，计算样品的测得浓度、SD和RSD%，精密度试验结果见表2。表2. 精密度试验结果（n=5）Tab.2 Results of HCPT of standard deviation in a day (n=5)加入浓度（ng/mL）日内精密度检测浓度（ng/mL）SDRSD% 2028.29 2.237.8720002245.89122.815.4780009154.41559.066.113.3.2 日间差 按“标准曲线制备”项下方法配制低、中、高3个浓
15、度的HCPT内酯血浆样品，连续测定5天，每天连续测定2次，随行标准曲线，计算样品的测得浓度、SD和RSD%，求得测定方法的日间差，数据见表3。试验数据表明，生物样本的分析方法符合有关规范要求。表3.标准曲线日间差考察（n=5）Tab.3 Results of HCPT of standard deviation inter-day (n=5)加入浓度（ng/mL）检测浓度（ng/mL）平均检测浓度SDRSD%12345 2030.3124.6123.3626.9426.2226.29 2.6410.0620002185.362528.712256.102142.502307.952284.12150.826.6080009205.209206.75
