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1、第十章吸光光度法教学目的：掌握光度法的基本原理，了解光度分析条件的控制，分光光度法的应用范围。教学重点：Beer定律；光度分析的应用。教学难点：光吸收原理；光度分析的准确度。吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法和分光光度法。分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选 择性吸收的特性而建立起来的分析方法。包括可见吸光光度法、紫外-可见吸光光度法和红外光谱法等。同滴定分析法、重量分析法相比，有以下一些特点灵敏度高： 测定下限可达105106mol/L, 10-4%10-5%的痕量组分准确度较高 相对误差
2、为2-5%；操作简便快速 ；应用广泛 第一节 物质对光的选择性吸收一、光的基本性质光是电磁波，以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量 1. 波动性光的传播速度:c真空中光速 2.99792458108m/s 波长，单位：m,cm,mm,mm,nm, 1mm=10-6m, 1nm=10-9m, 1=10-10m 频率，单位：赫芝（周）Hz 次/秒 n折射率，真空中为12. 微粒性光量子，具有能量。h普朗克(Planck)常数 6.62610-34Jsn频率E光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特) 3. 波粒二象性真空中:结论: 一定波长的光具有一定的能量，波长越长
3、(频率越低)，光量子的能量越低。单色光：具有相同能量(相同波长)的光。混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起。电磁波谱的波段如何划分?光按波长的长短顺序排列成谱，称。射线X 射线紫外光可见光红外光 微波 无线电波可见光: 作用于眼睛引起了颜色的感觉，我们把人眼所能看见有颜色的光 其波长范围大约在400-760nm之间实验证明：白光(日光、白炽电灯光、日光灯光等)是由各种不同颜色的光按一定的强度比例混合而成的。 如果让一束白光通过三棱镜，就分解为 红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光，这种现象称为光的色散。 每种颜色的光具有一定的波长范围;如果把适当颜色的两种单色光按一定的强度比例混合
4、，也可以成为白光。这两种单色光就叫做互补色二. 物质对光的选择性吸收1. 吸收原理M + h n = 激发态 E1 E E2DE = E2 - E1 = h n 量子化 ；选择性吸收; 分子结构复杂使其对不同波长光的吸 收程 度不同；2. 物质的颜色与吸收光的关系 当白光照射到物质上时，物质对于不同波长的光线吸收、透过、反射、折射的程度不同而使物质呈现出不同的颜色。 如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色； 如果完全反射，则呈现白色； 如果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现灰色； 如果物质选择性地吸收某些波长的光，那么，这种物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定。 例如，KMnO4溶
5、液选择吸收了白光中的绿色(500560nm)光，与绿色光互补的紫色光因未被吸收而透过溶液，所以KMnO4溶液呈现紫色硫酸铜溶液因吸收白光中的黄色光而呈蓝色任何一种溶液对不同波长的光的吸收程度是不相等的。 如果将某种波长的单色光依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种单色光的吸收程度， 吸收曲线:以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图即可得到一条吸光度随波长变化的曲线称之为吸收曲线或吸收光谱。吸收曲线的讨论：1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长(lmax)2）同一物质不同浓度的溶液，光吸收曲线形 状相似，其最大吸收波长不变；但在一定波长处吸光度随溶液的浓
6、度的增加而增大。可作为物质定量分析的依据。在实际测定时 只有在max处测定吸光度，其灵敏度最高， 因此，吸收曲线是选择测量波长的依据。3）不同物质吸收曲线的形状和最大吸收波长均不相同。 光吸收曲线与物质特性有关，故据此可作为物质定性分析的依据。第二节 光吸收的基本定律一、朗伯-比耳定律（一）朗伯-比耳定律的推导当一束平行单色光照射到任何均匀、非散 射的介质（固体、液体或气体）， 例如溶液时，光的一部分被介质吸收，一部分透过溶液、一部分被器皿的表面反射。 如果入射光的强度为I0，吸收光的强度为Ia透过光的强度为It,反射光的强度为Ir则它们之间的关系为 I0Ir+Ia+It 在分光光度测定中，盛
7、溶液的比色皿都是采用相同质量的光学玻璃制成的，反射光的强度基本上是不变的(一般约为入射光强度的4)其影响可以互相抵消，于是可以简化为 I0It+Ia1. 朗伯定律A=lg(I0/It)=k1b2.比尔定律A=k2c3. 朗伯-比尔定律A=kbc A 吸光度 b 介质厚度 c 浓度 K 吸光系数1) T透光率2) 吸光度(A)、透光率(T)与浓度(c)的关系A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT = kbc3）吸光系数当c的单位用gL-1表示时，用a表示， Aabc当c的单位用molL-1表示时，用 表示. A bc 摩尔吸光系数 表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为
8、1cm时，溶液的吸光度。我们不能直接取1mol/L这样高浓度的有色溶液来 测定 摩尔吸光系数值，而是在适宜的低浓度时 测定吸光度, 然后通过计算求得值。摩尔吸光系数(1)吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，可作为定性鉴定的参数；(2)不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，k仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；(3）同一吸收物质在不同波长下的k值是不同的 在最大吸收波长max处的摩尔吸光系数，常以kmax表示。 kmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力， 也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度 (4）kmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测
9、定该物质的灵敏度越高。 k105：超高灵敏； k=(610）104 ：高灵敏； k2104 ：不灵敏。(5) k在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。4). 桑德尔灵敏度 吸光光度法的灵敏度除用摩尔吸收系数表示外， 还常用桑德尔灵敏度S表示。 定义：当光度仪器的检测极限为A=0.001时，单位截面积光程内所能检出的吸光物质的最低质量（gcm-2）。即： S = M / k 可见，某物质的摩尔吸光系数k越大，其桑尔灵敏度S越小，即该测定方法的灵敏度越高。 4. 标准曲线的绘制及应用 配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定条件下进行测定吸光度 然后以吸光度为纵
10、坐标，以浓度为横坐标作图，得到一条标准曲线，也称做工作曲线 曲线的斜率为b，由此可得到摩尔吸收系数；也可根据未知液的Ax,在标准曲线上查出未知液的浓度cx。二、引起偏离朗伯-比耳定律的原因(一)物理因素1. 单色光不纯所引起的偏离 严格地讲，朗伯-比耳定律只对一定波长的单色光才成立。 但在实际工作中，目前用各种方法得到的入射光并非纯的单色光，而是具有一定波长范围的单色光 那么，在这种情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯比耳定律的偏离。2 .非平行入射光引起的偏离 非平行入射光将导致光束的平均光程b大于吸收池的厚度b，实际测得的吸光度将大于理论值。3介质不均匀性引起的偏离 朗
11、伯-比耳定律是建立在均匀、非散射基础上的一般规律、如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态存在，则入射光除了被吸收之外、还会有反射、散射作用。 在这种情况下，物质的吸光度比实际的吸光度大得多，必然要导致对朗伯-比耳定律的偏离。 二）化学因素1溶液浓度过高引起的偏离 朗伯-比耳定律是建立在吸光质点之间没有相互作用的前提下。但当溶液浓度较高时，吸光物质的分子或离子间的平均距离减小，从而改变物质对光的吸收能力，即改变物质的摩尔吸收系数。 浓度增加，相互作用增强，导致在高浓度范围内摩尔吸收系数不恒定而使吸光度与浓度之间的线性关系被破坏。2. 化学变化所引起的偏离 溶液中吸光物质常因解离、缔合、形成新的化
12、合物或在光照射下发生互变异构等，从而破坏了平衡浓度与分析浓度之间的正比关系， 也就破坏了吸光度A与分析浓度之间的线性关系产生对朗伯-比耳定律的偏离。第三节 吸光光度法的仪器一、基本部件 一般由光源、单色器（分光系统）、吸收池、检测系统和信号显示系统等五部分组成。 （一）光源 发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。 可见光区： 钨灯，碘钨灯(320 2500 nm)紫外区： 氢灯，氘灯 (180 375 nm)（二）单色器（分光系统）将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。棱镜:玻璃350 3200 nm, 石英185 4000 nm光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用
13、方便入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅聚焦装置：将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝出射狭缝：（三）.吸收池(比色皿):用于盛待测及参比溶液。玻璃 仅适用于可见光区石英 适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）（四） 检测器：利用光电效应，将光能转成电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管（五） 信号显示系统低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录二、吸光度的测量原理 分光光度计实际上测得的是与透射光强度成正比的光电流或电压， 通过转换器将测得的电流或电压转换为对应的吸光度A。测定时，只要将待测物
14、质推入光路即可直接读出吸光度值。测定步骤： 1调节检测器零点，即仪器的机械零点。 2应用不含待测组分的参比溶液调节吸光零点。 3. 待测组分吸光度的测定。三、分光光度计的类型第四节 吸光光度法分析条件的选择一、显色反应及其条件的选择（一）显色反应和显色剂 1. 显色反应在分光光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。 显色反应可分两大类，即络合反应和氧化还原反应而络合反应是最主要的显色反应。 与被测组分化合成有色物质的试剂称为显色剂。 同一组分常可与若干种显色剂反应，生成若干有色化合物，其原理和灵敏度亦有差别。 一种被测组分究竞应该用哪种显色反应，可根据所需标准加以选择。选择显色反应的一般标准 : (1) 选择性要好。 一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应这样干扰就少。或者干扰离子容易被消除、或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰相隔较远。 (2)灵敏度要高。 由于吸光光度法一般是测定微量组分的，灵敏度高的显色反应有利
