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1、ICS 07.060CCS A 45中 华HY人 民 共 和 国 海 洋 行 业 标 准HY/T XXXXXXXXX海水中大肠杆菌、肠球菌和霍乱弧菌的检测 实时荧光 RNA 恒温扩增法Detection of Escherichia coli 、Intestinal Enterococci and Vibrio cholera in seawatersimultaneous amplification and testing method(报批稿)XXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施中华人民共和国自然资源部 发 布XX/T XXXXXXXXX目 次前言 II1
2、范围 32 规范性引用文件 33 术语和定义 34 方法原理 45 试剂或材料 46 仪器和设备 57 样品的采集和预处理 68 检测步骤 69 报告结果 910 质量控制 1011 废物处理 10附录 A(规范性)引物探针序列 11附录 B(规范性)检测过程用表 13参考文献 14IXX/T XXXXXXXXX前 言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国自然资源部提出。本文件由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC 283)归口。
3、本文件起草单位：自然资源部第一海洋研究所，江阴海关综合技术服务中心。本文件主要起草人：郑立、李倩、徐希媛、韩阳春、高伟、田雯、张彦超、徐金祥、王帅、沈浩、 何昌飞、张毅然、朱磊。IIHY/T XXXXXXXXX海水中大肠杆菌、肠球菌和霍乱弧菌的检测 实时荧光 RNA 恒温扩增法1 范围本文件规定了采用实时荧光RNA恒温扩增法检测海水中大肠杆菌、肠球菌和霍乱弧菌的方法原理、 试剂和材料、仪器和设备、样品采集和预处理、检测步骤、剩余样品处理、质量控制等内容。本文件适用于海水中大肠杆菌、肠球菌和霍乱弧菌(O1 群和 O139 群) 的活菌检测。淡水、半咸水 及船舶压载水检测可参照使用。2 规范性引用
4、文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件； 不注日期的引用文件， 其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本 文件。GB/T 6682-2016 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 12763.62007 海洋调查规范 第6部分：海洋生物调查3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光 RNA 恒温扩增 simultaneous amplification and testing；SAT核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合， 通过对核酸扩增产物的荧光信号进行实时检测， 从 而快速准确检测靶标微生
5、物的一种新型核酸检测技术。3.2靶标 target用于检测目标微生物的特异性RNA片段序列。3HY/T XXXXXXXXX3.3循环阈值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。3.4内质控 internal control体外合成的一段 RNA 片段。注： 其序列与靶标 RNA 序列不匹配，用于核酸提取和扩增时的质量控制。4 方法原理靶标RNA在反转录酶作用下产生互补DNA，RNA聚合酶以互补DNA为模板产生多个RNA拷贝扩增产物， 带有荧光标记的RNA探针和扩增的靶标RNA特异结合产生荧光， 由荧光定量PCR仪获得循环阈值(Ct值) ， Ct值与初
6、始模板量成反比，根据Ct值判断检测结果。5 试剂或材料5.1 实验用水应符合GB/T 6682-2016中一级水的要求。5.2 样本裂解保存液50 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) (pH7.0) ， 0. 1% (V/V) 十二烷基硫酸钠(SDS) ， 1%(V/V) 聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100) ， 0.1%(V/V) 乙基苯基聚乙二醇， 室温保存， 有效 期 2 年。5.3 标准菌株采用编号为ATCC 25922的大肠杆菌和编号为CGMCC 1.2024的粪肠球菌(Enterococcus faecalis) 作为标准菌株。5.4 核酸提取液4HY/T XXXX
7、XXXXX4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (50400) mmol/L， 乙二胺四乙酸(EDTA) (40200) mmol/L， 氯化 锂 (4002000) mmol/L，0.25 M 待测菌株探针和250 mg/mL 磁珠， 4 保存， 有效期 1 年。探 针序列见附录A.1。5.5 大肠杆菌或肠球菌上游引物扩增检测液Tris 25 mmol/L，氯化镁 10 mmol/L，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)1 mmol/L，NTPs 5 mmol/L， 5%(V/V)丙三醇的溶液，含有 0.25 mol/L 靶标上游引物，0.075 mol/L 内质控上游引物。靶标 引物为扩增大肠杆菌或肠球菌特异
8、性RNA片段的引物， -20 保存， 有效期 1 年。引物序列见附录A.1 和附录A.2。5.6 大肠杆菌或肠球菌下游引物扩增检测液Tris 25 mmol/L，氯化镁 10 mmol/L，dNTPs 1 mmol/L，核糖核苷三磷酸(NTPs) 5 mmol/L， 5% (v/v)丙三醇的溶液，含有 0.25 mol/L 靶标下游引物， 0.19 mol/L 内质控下游引物，0.25 mol/L靶标核酸检测探针和 0.25 mol/L内质控检测探针。靶标引物为扩增大肠杆菌或肠球菌特异性 RNA片段的引物， -20 保存，有效期 1 年。引物和探针序列见附录A.1和附录A.2。5.7 洗涤液4
9、-羟乙基哌嗪乙磺酸 (550) mmol/L，氯化钠 150 mmol/L，1% SDS，EDTA (110) mmol/L。5.8 SAT 酶液含有2000U M-MLV反转录酶、2000U T7 RNA 聚合酶，20 mmol/L Tris，0.1(V/V)TritonX-100， 30 mmol/L 氯化钾，0.01 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L 二硫苏糖醇，50 (V/V) 丙三醇， -20 保存， 有效期 1 年。5.9 霍乱弧菌扩增检测液Tris 25 mmol/L， 氯化镁 10 mmol/L， dNTPs 1 mmol/L， NTPs 5 mmol/L， 5%(
10、v/v)丙三醇的 溶液， 含有 0.25 mol/L 靶标上游引物，0.25 mol/L 靶标下游引物，0.075 mol/L 内质控上游 引物， 0.19 mol/L 内质控下游引物， 0.25 mol/L靶标核酸检测探针和 0.25 mol/L内质控检测探 针。引物为霍乱弧菌的特异性引物， -20 保存，有效期 1 年。引物探针序列见附录A.1和附录A.2。6 仪器和设备5HY/T XXXXXXXXX6.1 无菌玻璃瓶：500 mL，清洗后 121高压灭菌 15 min。6.2 微孔滤膜过滤器。6.3 无菌醋酸纤维膜：水系，孔径 0.45 m，直径 25 mm。6.4 镊子：121高压灭菌
11、 15 min。6.5 离心管：容量为 1.5 mL 和 2 mL，121高压灭菌 15 min。6.6 水浴锅：室温至 100 范围内任意调节，最大温度误差不大于 1 。6.7 单道微量移液器：规格为 10 L、200 L 和 1000 L，配枪头，枪头 121高压灭菌 15 min。 6.8 超净工作台。6.9 涡旋振荡器：范围 0 r/min2500 r/min。6.10 磁珠分离核酸提取磁力架。6.11 96 孔板及封板膜：根据不同仪器配套规格为全透明或白色 96 孔板，配高透光封板膜。 6.12 金属浴锅：室温至 100 范围内任意调节，最大温度误差不大于 1 。6.13 实时荧光定
12、量聚合酶链式反应仪。6.14 高温压力灭菌锅。7 样品的采集和预处理针对每种检测微生物，采用无菌玻璃瓶现场采集1000 mL水样，样品的保存按照GB/T 12763.6-2007 中6.1.1.3 的规定进行。大肠杆菌和肠球菌取100 mL水样、霍乱弧菌取250 mL水样，采用微孔滤膜过滤器过滤至无菌醋酸纤 维膜上，用镊子将膜折叠，放入1.5 mL离心管中，添加1 mL样本裂解保存液作为待测样本，其中肠球菌 待测样本应置于水浴锅中90 加热10 min以促进细胞裂解。待测样本在-20条件下可保存1个月。每 份样品做3个平行。8 检测步骤8.1 大肠杆菌和肠球菌8.1.1 标准菌株制备6HY/T
13、 XXXXXXXXX标准菌株的复苏根据说明书中提供的要求进行培养，培养至光密度600nm时的吸光度值(Optical Density，OD600)为0.40.8，通过平板计数法计算菌落数。采用单道微量移液器取100 L添加至2 mL 的离心管， 添加900 L的样本裂解保存液。按照表1用样本裂解保存液进行十倍梯度稀释并记录相应编 号， 作为阳性标准品(-20条件下可保存1个月) ，用于定量检测样品浓度的标定。该步骤需在超净工 作台内完成。阳性标准品设置3个平行样，与样本RNA提取同步进行。表1 大肠杆菌、肠球菌稀释后的浓度类别稀释后的浓度梯度CFU/mL大肠杆菌1102 ，1103 ，1104
14、 ，1105肠球菌110，1102 ，1103 ，11048.1.2 试剂准备取出核酸提取液平衡至室温； 取出大肠杆菌或肠球菌上游引物扩增检测液和下游引物扩增检测液置 于水浴锅中60 加热10 min。8.1.3 提取和加样提取和加样步骤如下：a)取出待测样本， 涡旋振荡器振荡30 s。使用单道微量移液器取250 L的待测样本加入至新的 1.5 mL离心管，再加入200 L核酸提取液，颠倒混匀，样本裂解保存液作为阴性对照与待测样 本同步提取加样，阴性对照设置3个平行样；b) 将离心管放入水浴锅中，60 水浴加热10 min，室温放置冷却10 min；c) 将离心管置于磁珠分离核酸提取磁力架上，静置5 min，使用单道微量移液器吸除液体，保留 管内的磁珠；d) 使用单道微量移液器向离心管中加入700 L洗涤液，涡旋振荡器混匀30 s后，重复一次步骤c)； e) 重复步骤d)；f) 使用单道微量移液器向离心管中加入40 L大肠杆菌或肠球菌上游引物扩增检测液， 震荡混匀， 形成重悬液；g) 使用单道微量移液器将重悬液添加到96孔板中， 贴好封板膜， 放入42 金属浴锅中保温3 m
