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1、综合实验一 -淀粉酶的摇瓶发酵一、 实验目的1、 掌握微生物发酵的基本流程；2、 通过淀粉的发酵制过程掌握菌种制备、发酵过程控制、中间参数测定等基本生物工程技术。二、 实验原理1、 枯草芽胞杆菌2、 DNS法测还原糖3、 -淀粉酶活性测定4、 -淀粉酶效价测定三、 仪器与材料1、 发酵培养基：葡萄糖（1.5%），玉米淀粉(0.2%)，酵母膏(0.02%)，蛋白胨(3%)，氯化铵(0.01%)，硫酸镁(0.05%)，磷酸二氢钠(0.15%)，磷酸氢二钠(0.3%)；2、 菌种：枯草芽胞杆菌；3、 试剂：1mol/L NaOH，1mol/LHCl、pH6.0的磷酸缓冲液、葡萄糖标准液（1mg/mL
2、）、DNS溶液（棕色瓶储藏）、稀碘液、LB液体培养基（蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L，氯化钠10g/L）等；4、 其它：天平，药匙，广泛pH试纸，玻璃棒，不锈钢烧杯，250ml的三角瓶，纱布，报纸，棉线，电炉，电磁炉，带塞比色管，试管架，漏斗，1ml、5ml移液管，洗瓶，废液瓶，蒸馏水，滤纸，比色皿，取液器，枪盒，枪头，酒精灯，打火机，振荡培养箱，分光光度计，水浴锅等。四、 实验方法1、 菌种活化：将保藏的菌种转接到斜面培养基上，37培养24h；2、 种子液制备：取一环活化的菌种接入装量为50mL的种子培养基，37，180rpm培养18h；3、 接种培养：分别取2ml种子液，接入到发酵培养集
3、中固定置恒温振荡培养箱中，32，160rpm培养48h.4、 葡萄糖标准曲线的绘制分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25ml带塞比色管中，分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15ml刻度。在540nm波长下测定吸光度。5、 发酵液：取发酵液5ml，过滤，备用；6、 DNS测定：取发酵滤液适当稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数。求
4、出样品中糖含量；7、 -淀粉酶活性的测定：吸取20.0ml可溶性淀粉溶液于试管中，加入5.0ml缓冲液摇匀后，于600.2恒温水浴中预热5min。加入稀释好的待测酶液1.0ml，立刻计时，摇匀，准确反应5min。立即吸取1.0ml反应液，加到预先盛有0.5ml盐酸溶液（0.1mol/ml）和5.0ml稀碘液中，摇匀，并以0.5ml盐酸溶液（0.1mol/ml）和5.0ml稀碘液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度（A），根据其吸光度查表（见表1），求得测试酶液的浓度（cU/ml）.8、 淀粉酶效价测定：（1）配制淀粉培养基，2%淀粉，2%琼脂；（2）水解淀粉圈实验：用打
5、孔器在平皿中央打孔，取0.1ml不同时间取样的发酵液于孔中，最后将平皿放置于30左右培养箱中培养并观察。五、 结果与分析1、 根据该实验，查阅资料，写出一种适合该发酵液中淀粉酶提取的实验方案。2、 记录0，12，24，36，48小时各时间段，pH、DNS、酶活值，分别以表格和图形形式表示。3、 绘制淀粉酶效价（透明圈直径表示）变化曲线。4、分析实验结果DNS试剂：酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.03g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中，室温保存 但是一定要注意，3，5-二硝基水杨酸
6、和NaOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NaOH。否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。且配置过程中，溶液加热温度不宜超过50摄氏度。pH6.0的磷酸缓冲液：称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）和8.07g柠檬酸（C6H8O7H2O），用水溶解并定容至1000mL。用pH计校正后使用。原碘液：称取11.0g碘和22.0碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，贮存于棕色瓶中。稀碘液：吸取原碘液2.00ml，加20.0g碘化钾用水溶解并定容至500ml，贮存于棕色瓶中。可溶性淀粉溶液（20g/L）：称取2.000g（精确至0.001g）可溶性淀粉（以绝干计）于烧杯中
7、，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100mL。溶液现配现用。（注：可溶性淀粉就采用湖州展望化学药业有限公司生产的酶制剂专用可溶性淀粉。）DNS法测还原糖：DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中。
