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1、项目名称：干细胞分化表观遗传学调控及其治疗糖尿病应用基础研究首席科学家：赵春华 中国医学科学院基础医学研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部门：卫生部二、预期目标1. 学术思路本项目理论依据是按胰和肾的胚胎发育程序诱生胰和肾的器官特异性干/祖细胞。受精卵形成人体最原始的干细胞，后进入器官发育阶段是连续的。但胚胎发育过程中细胞基因表达编程显示阶段特征，从而形成了细胞发育的等级分化概念。器官特异性干细胞作为一个发育阶段其基因表达程序又受控于细胞内外关键信号分子的调控，因此有可能按器官的胚胎发育程序诱导器官特异性干细胞。干细胞定向分化由复杂的调控网络控制，涉及多个功能基因开启与关闭，转录因
2、子在决定基因是否表达及转录效率起重要作用。而参与其转录调控的组蛋白修饰及核小体重塑尤其是组蛋白甲基化占据核心位置。课题将围绕在ESC/MSC向胰岛祖细胞和肾祖细胞定向分化过程中起关键作用的特异转录因子这个核心，从转录水平和转录后水平阐明基因表达变化、分子间相互作用和正负反馈调节规律和机制，建立以控制定向分化特异转录因子为核心多维动态表观遗传学修饰调控网络。在此基础上，为干细胞治疗研究领域提供有价值的原始资料和科学依据，为糖尿病、肾病的细胞治疗提供新思路、新材料和新技术。2. 技术途径 图3：项目实施技术路线图A. 采用人ESC和人早期中胚层细胞作为种子细胞，按照胰和肾的胚胎发育程序选择诱导因子
3、。B. 通过sRNA/microRNA分离和富集关键技术、组合芯片和已商业化的Solexa测序技术系统解析人内源性sRNA在干细胞定向分化过程中特征表达谱，阐明内源性sRNA、DNA甲基化、组蛋白修饰与转录因子等关键靶基因表观遗传学多维网络调控。C. 采用分子影像示踪技术分析移植细胞体内分化和功能定位，评价动物模型病损器官中移植细胞的体内组织修复和功能重建。D. 完成干细胞技术产品的安全性、有效性和稳定性的临床前研究。3. 创新点与特色A. 建立并获得用于临床移植的胰脏和肾脏干/祖细胞诱导分化体系；明确干细胞治疗体内疗效的影像学评价标准规范；B. 建立多潜能干细胞向胰岛祖细胞或肾祖细胞定向分化
4、过程中决定分化关键转录因子与sRNA/microRNA、DNA甲基化差异图谱及组蛋白修饰的多维动态图谱；C. 针对糖尿病肾病在国际上首次从种子干细胞诱导分化、体内有效性机制、临床应用安全性等方面进行系统科学设计和验证，具有国际竞争优势，也是本项目特色。4. 可行性分析A. 选择多潜能干细胞诱导成胰肾干/祖细胞作为理想种子细胞研究的可行性分析在胚胎干细胞研究方面，本项目团队于2001年率先在国内建立了人类ESC系，2007年建立了国际上第一个基因组完全纯合的人类孤雌ESC系。目前，利用人类辅助生殖治疗中废弃胚胎已建成国际上最大库容量的人ESC库，含有245株的hESC系，所具有的丰富的遗传背景，
5、为研究ESC系之间的差异提供了丰富的材料，并能够为人ESC向胰腺内分泌干/祖细胞诱导分化的研究提供合适的hESC系。已完成对库中180株ESC系的鉴定（Cell Stem Cell，2009），团队也积累了丰富的评价干细胞多能性的技术基础。在成体干细胞研究方面，本项目团队在国际最早开展了成体干细胞基础研究、应用技术开发和临床应用，将成体干细胞体外规模化制备及其技术应用作为核心目标，重点开展了成体干细胞基础生物学特性及功能评价技术研究，经过10年研发首次从人成体组织中分离到多能成体干细胞亚群，并在体内外成功诱导该类细胞向三胚层多系分化；建立了成体干细胞体外规模化制备工艺及技术体系。以上工作成果为
6、从事ESC和成体干细胞分离鉴定、细胞生物学特征及分化机制研究奠定了良好基础。ESC及成体干细胞诱导为胰腺及肾组织特异性干细胞，是其调控机制研究及应用于治疗糖尿病及其并发症糖尿病肾病的治疗的关键步骤。基于体外模拟胰腺体内发育规律的思路，本项目已采用改良的四步法，诱导人类孤雌ESC分化为有功能的胰岛样细胞团。为研究人ESC向胰腺干/祖细胞以及胰岛素分泌细胞的诱导分化的相关研究提供基础平台。. 本项目团队目前已初步建立了人ESC向胰岛素分泌细胞诱导分化体系。：本项目已初步建立的成体干细胞向肾组织细胞的体外诱导分化体系。体内移植试验也已经初步提示成体干细胞在治疗肾脏疾病的可行性（Stem Cells
7、Dev. 2010）。B. 开展干细胞分化表观遗传学调控机制研究的可行性分析大量的试验证据表明：与终末分化的体细胞不同，干细胞和组织前体细胞内组蛋白修饰和核小体重塑占核心地位，最新研究组蛋白H3第4位和第27位赖氨酸的三甲基化修饰并存，推测这种bivalent 修饰可能使基因处于一种易于被转录的状态。本项目团队已经鉴定早期中胚层干细胞关键的多胚层转录因子具bivalent 修饰，为开展多系分化诱导研究奠定了基础。. 已发现组蛋白修饰对胰/肾祖细胞分化过程的生物学效应机制. 发现了新的染色质调控因子基于本项目团队以前鉴定过3个新的组蛋白去甲基化酶的工作经历（Nature. 2007. 447(7
8、144):601-5.），在发现和寻找新的染色质调控因子方面已经积累了经验。因此，本项目将继续在发现和寻找如下未知的组蛋白/染色质调控因子方面开展工作。以期丰富对表观遗传学调控的全貌认识，为找到并鉴定出胰/肾祖细胞分化过程中发挥重要作用的染色质调控因子打下了良好基础。C. 干细胞体内功能分析评价技术的可行性分析分析评价干细胞移植治疗糖尿病后在受体内的生物学功能，必须结合干细胞的标记和示踪。目前本项目团队已经利用分子影像方法进行了干细胞治疗功能评价的初步研究。. 生物荧光与GFP融合基因的分子影像技术（PLoS ONE, 2009; Stem Cells, 2008; J Mol Cell Ca
9、rdiol, 2007）。. 报告基因的PET成像技术（J Mol Cell Cardiol, 2007; Cloning Stem Cells, 2007）。. 纳米铁粒子标记干细胞技术（Stem Cells，2008；）。D. 干细胞治疗糖尿病安全性、有效性研究的可行性分析为进一步探讨诱导分化后得到的特异性干细胞在糖尿病及其并发症糖尿病肾病治疗的有效性和安全性研究方面，需要具备动物模型和相关有效性、安全性评价的经验。提出并建立了亚全能干细胞再生修复新方法；利用成体干细胞进行了多靶点组织的干细胞治疗，建立了成体干细胞体外规模化制备工艺技术流程和功能评价体系，制定出干细胞（药物）产品的质量控制
10、标准和SOP操作规范体系；已建立大、小动物模型平台，掌握了制作相关疾病动物模型的技术，研制出我国第一个干细胞新药“骨髓原始间充质干细胞”，获得了国家食品药品监督管理局（SFDA）临床试验批件。三、研究方案1. 学术思路本项目理论依据是按胰和肾的胚胎发育程序诱生胰和肾的器官特异性干/祖细胞。受精卵形成人体最原始的干细胞，后进入器官发育阶段是连续的。但胚胎发育过程中细胞基因表达编程显示阶段特征，从而形成了细胞发育的等级分化概念。器官特异性干细胞作为一个发育阶段其基因表达程序又受控于细胞内外关键信号分子的调控，因此有可能按器官的胚胎发育程序诱导器官特异性干细胞。干细胞定向分化由复杂的调控网络控制，涉
11、及多个功能基因开启与关闭，转录因子在决定基因是否表达及转录效率起重要作用。而参与其转录调控的组蛋白修饰及核小体重塑尤其是组蛋白甲基化占据核心位置。课题将围绕在ESC/MSC向胰岛祖细胞和肾祖细胞定向分化过程中起关键作用的特异转录因子这个核心，从转录水平和转录后水平阐明基因表达变化、分子间相互作用和正负反馈调节规律和机制，建立以控制定向分化特异转录因子为核心多维动态表观遗传学修饰调控网络。在此基础上，为干细胞治疗研究领域提供有价值的原始资料和科学依据，为糖尿病、肾病的细胞治疗提供新思路、新材料和新技术。2. 技术途径 图3：项目实施技术路线图A. 采用人ESC和人早期中胚层细胞作为种子细胞，按照
12、胰和肾的胚胎发育程序选择诱导因子。选择来源于人ESC的Sox17+限定性内胚层细胞向Pdx1+胰腺干细胞分化阶段和Bry+Flk1+MSC向Pax2+肾祖细胞分化阶段，进行序贯诱导。B. 通过sRNA/microRNA分离和富集关键技术、组合芯片和已商业化的Solexa测序技术系统解析人内源性sRNA在干细胞定向分化过程中特征表达谱，阐明内源性sRNA、DNA甲基化、组蛋白修饰与转录因子等关键靶基因表观遗传学多维网络调控。C. 采用分子影像示踪技术分析移植细胞体内分化和功能定位，评价动物模型病损器官中移植细胞的体内组织修复和功能重建。D. 完成干细胞技术产品的安全性、有效性和稳定性的临床前研究
13、。3. 创新点与特色A. 建立并获得用于临床移植的胰脏和肾脏干/祖细胞诱导分化体系；明确干细胞治疗体内疗效的影像学评价标准规范；B. 建立多潜能干细胞向胰岛祖细胞或肾祖细胞定向分化过程中决定分化关键转录因子与sRNA/microRNA、DNA甲基化差异图谱及组蛋白修饰的多维动态图谱；C. 针对糖尿病肾病在国际上首次从种子干细胞诱导分化、体内有效性机制、临床应用安全性等方面进行系统科学设计和验证，具有国际竞争优势，也是本项目特色。4. 可行性分析A. 选择多潜能干细胞诱导成胰肾干/祖细胞作为理想种子细胞研究的可行性分析在胚胎干细胞研究方面，本项目团队于2001年率先在国内建立了人类ESC系，20
14、07年建立了国际上第一个基因组完全纯合的人类孤雌ESC系。目前，利用人类辅助生殖治疗中废弃胚胎已建成国际上最大库容量的人ESC库，含有245株的hESC系，所具有的丰富的遗传背景，为研究ESC系之间的差异提供了丰富的材料，并能够为人ESC向胰腺内分泌干/祖细胞诱导分化的研究提供合适的hESC系。已完成对库中180株ESC系的鉴定（Cell Stem Cell，2009），团队也积累了丰富的评价干细胞多能性的技术基础。在成体干细胞研究方面，本项目团队在国际最早开展了成体干细胞基础研究、应用技术开发和临床应用，将成体干细胞体外规模化制备及其技术应用作为核心目标，重点开展了成体干细胞基础生物学特性及
15、功能评价技术研究，经过10年研发首次从人成体组织中分离到多能成体干细胞亚群（Flk1+Lin-表型，Flk1+MSCs），并在体内外成功诱导该类细胞向三胚层多系分化；建立了成体干细胞体外规模化制备工艺及技术体系。以上工作成果为从事ESC和成体干细胞分离鉴定、细胞生物学特征及分化机制研究奠定了良好基础。ESC及成体干细胞诱导为胰腺及肾组织特异性干细胞，是其调控机制研究及应用于治疗糖尿病及其并发症糖尿病肾病的治疗的关键步骤。基于体外模拟胰腺体内发育规律的思路，本项目已采用改良的四步法分阶段加入活化素、视黄酸、烟碱、肠促胰岛素类似物，重组人-细胞调节素等因子，诱导人类孤雌ESC分化为有功能的胰岛样细胞团。终末分化细胞光镜下呈团状聚集，RT-PCR、免疫荧光染色检测分化细胞表达胰岛细胞特征性的基因与蛋白。胰岛素释放实验和电镜检测提示获得的细胞具有胰岛样生化功能。可为研究人ESC向胰腺干/祖细胞以及胰岛素分泌细胞的诱导分化的相关研究提供基础平台。. 本项目团队目前已初步建立了人ESC向胰岛素分泌细胞诱导分化体系。图4：干细胞诱导分化模式图谱图5：诱导分化不同阶段相关标记的RT-PCR和免疫荧光染色检测结果CAB 图6：诱导终末阶段的细胞的相关标记的检测结果和胰岛素释放实验结果A.分泌标记；B.分泌功能相关标记；C.诱导终末细胞团在5.5mM和25mM两个糖浓度
