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1、地衣共生菌藻的分离与培养地衣是一种真菌，由地衣共生菌和一种藻类或蓝细菌（蓝藻）的共生而形成的联合体，属“二元”生物体。在这个二元共生联合体中，真菌菌丝缠绕大量的光合细胞。在上述地衣的定义我们可以提出这样的一个问题：地衣是否可分为单个生物体？地衣生物学研究的许多方面均涉及到这些不同有机组织的相互作用。对于共生体的分离和培养研究，为科学家对于地衣共生关系本质的探讨提供了迷人的前景。该研究的中心问题是地衣光合共生物以及地衣共生菌的培养，这也是解决地衣生理、形态、发育和分子生物学等方面研究的根本问题。 地衣共生体的培养曾经被认为难以进行，这主要是因为这是一项很耗时的工作，而且共生体的培养是否成功需要长
2、期的技术探索。然而，Ahmadjian（1967b）突破性的研究引起了许多地衣学者对共生菌藻培养的兴趣。在过去的二三十年间，关于地衣共生菌藻的研究和地衣的人工重建已取得了相当的成就，如图一所示，地衣共生菌藻培养可以通过各种不同的方法而实现。地衣共生体的培养很难，即使用具富营养的培养基。主要是因为共生菌的生长远远快于共生藻或蓝细菌。此外，霉菌、酵母菌和细菌等的污染也是很重要的因素。因此在所有的操作过程中要进行无菌操作以防污染。本章的目的在于讲述从地衣中分离出共生菌藻并进行培养的方案。子方案I讲述了地衣共生菌培养的各种方法。子方案II讲述了地衣共生藻培养的各种技术。这些培养技术已有报道，但我们在此
3、研究的基础上又添加了一些新的内容。关于共生体的分离技术已有Ahmadjian（1967a,b）和Galum（1988）全面的描述了。子方案I 共生菌的培养注意：除了每一个清洗步骤，所有的操作都应在超净工作台上或无菌的条件下进行。所有的仪器在用之前都应高压灭菌（1520分钟，121，1 atm）或干热灭菌（30分钟，180）。一、仪器与材料仪器：显微镜、解剖镜、相差显微镜、高压灭菌锅、培养箱、超声波发生机、离心机、超净工作台或无菌工作室。真菌来源：我们建议所用的地衣应为野外新采集的而且在一周内利用。然而地衣也可以在干燥状态下保存几周，或在冰箱内存放几年（Yoshimura et al. 1990
4、)。共生菌可以从子囊孢子、分生孢子、裂芽、粉芽和菌体碎片中分离出来（Ahmadjian 1993）。用来实验室培养最常见的共生菌分离方法是：孢子释放法，主要是子囊孢子。获得共生菌藻的另一个方法是解剖菌体切片，这样会形成大量较纯的共生菌，在第二章我们将详细介绍从菌体碎片中获得共生菌和藻的方法。保存在Akita profectue University和Kochigakuen college的培养真菌可见表1。（P713）。真菌培养基： Ahmadjian（1993）和Pyatt（1973）建议用来孢子收集和萌发的培养基应含营养量低。可在15黑暗条件下，采用含水4%的琼脂培养基以取得了较好的效果。
5、这类共生菌的培养基如下：WA4培养基含4%蒸馏水的琼脂培养基琼脂 4克 蒸馏水补足100ml MY培养基麦芽酵母提取物培养基（ahmadjian 1967 a）麦芽提取物 20克 酵母提取物 2克 琼脂 20克 蒸馏水 蒸馏水补足1000ml LB培养基Lilly and Barnett s培养基（Lilly和Barnett 1951） 葡萄糖 10.0克 天冬酰胺酸（Asparagine) 2.0克KH2PO4 1.0克 MgSO47H2O 0.5克Fe（NO3)39H2O 0.2 mg ZnSO47H2O 0.2mgMnSO44H2O 0.1mg 维生素B1（Thiamine) 0.1mg
6、维生素H（Biotin) 5ug 蒸馏水补足 100ml可以在以上组分上加入1520g的琼脂，并补足 1000ml，并制成固体培养基。LBG 培养基Lilly and Barnetts Gelrite 培养基LB培养基中以1%的w/v Gelrite 代替琼脂。注意：在利用和倒入皮氏培养皿（5mm）或试管（5ml）之前，应将所有培养基进行灭菌。二、实验步骤 （一）通过孢子分离出共生菌孢子释放： 1.把野外采集的地衣体洗净，放置几天使其于周围环境达到水分平衡。也可以将材料清洗和冷冻，在用之前平衡几个小时。2.从地衣体上取下子囊盘或子囊壳，并将其在放有蒸馏水的培养皿中浸泡4小时或在流动水中清洗。通
7、过挤压去除多余的水分。3.将其用凡士林固定在皮氏皿底部，然后用含水4%的琼脂培养基盖在培养皿上部，将培养基放在培养皿的上面盖上，并防止琼脂污染。4.确保琼脂在孢子的释放范围之内（大约510mm），释放的孢子会单个或成团的附着的琼脂的表面。如果要进行单孢子分离可以通过减少孢子的释放时间或增加子囊果同琼脂之间的距离；否则会得到的是孢子团。在适当的间隔（依据于释放时间，通常一天）多次的旋转琼脂层。另外在潮湿的环境中也可以释放到玻璃片上或无菌的薄膜上，然后用蒸馏水将孢子冲下，立即转移到培养基上。5.用超薄膜将皮氏皿封口，在培养箱中进行培养，条件为无光、15。6.为了检验孢子萌发情况，可以在相差显微镜下
8、，观察孢子的释放情况。将释放的孢子转移到含有琼脂培养基的玻片上进行观察。保持皮氏培养皿玻片的潮湿，并连续观察。可以在水中或通过染色法（lactic-glycerol-cotton blue）观察孢子的萌发和菌丝体的生长情况。孢子萌发和菌丝体生长：有些地衣的孢子会在散出后的一天内萌发。萌发后，将含有孢子的琼脂小块切下并转移到含有营养培养基的皮氏培养皿或试管中。最常用的培养基为麦芽酵母提取物培养基MY培养基和LB培养基。（二) 从地衣体中分离出共生菌。由于有些地衣不产生子囊盘或成熟孢子，或者孢子萌发率低，这时候分离共生菌可用另外一个材料来源，如分生孢子（Vobis 1997）或粉芽（Honegge
9、r and Bartnicki-Garcia1991；Hovegger et al. 1993)。由于裂芽经常被一些附生的微生物所污染，故不常用来分离共生菌。Yamamoto et al（1985）已经列出了采用地衣碎片分离出共生菌的方法。这可见于第二章。1.用消毒的刮胡刀将新鲜的地衣切成薄片，然后存放于不含营养仅含水的小试管中或放在15环境下的潮湿的滤纸片上。然后将冲洗后的地衣体碎片在研钵中磨碎并加水混匀成悬浮液。经过滤后的滤液再经过第二次过滤。从第二次过滤的滤纸上取出少部分接种至斜面培养基上。新的髓状菌丝通常会在二三周后延长。采用无菌技术切取一部分新长出的菌丝，转移到试管培养基上。我们发现
10、这种方法对于获的鹿蕊（Cladia rangiferina）和大叶梅（Paramotrema tinctorum）的共生菌很适用。2.应当对此实验进行多次重复，以保证生长的真菌最有可能为共生菌而不是生长于地衣体表面或内部的其他真菌。（三）培养共生菌的保存共生菌可以存放很长时间 （大约一年左右）。但是，最好在两三个月内按如下步骤进行一次继代培养。利用解剖刀将培养的共生菌分为几部分（通常为5mg）。将各个部分放在皮氏培养皿中的MY培养基或LB培养基中，在15无光条件下培养23个月。每2至3个月重复一次该步骤。通常共生菌在1520时表现出最大生长率。在共生菌的培养中，培养基的pH值对群体生长有着重要
11、的影响。每种共生菌均有其最适生长pH值，通常pH范围为56，太高或太低的pH均会阻碍其生长。在共生菌群体保存培养中，光并不是必须的。地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍具有活性。 三、注释1.孢子的释放 对于许多地衣来说，在将子囊盘放在皮氏培养皿一天之内就可观察到孢子释放。然而，有些地衣却只有在二三周后才可观察到孢子释放表2（P18）。将子囊盘放在皮氏培养皿后，孢子第一次释放时间变化很大。孢子释放的时间主要取决于地衣种类以及子囊盘采集时发育和代谢状况，以及采集后的地衣体处理和子囊果的年龄。同样，孢子释放的数目和释放的持续时间也有很大的变化也取决以上因素。将其浸放水中约15分钟至24小时，然后
12、吸干并放在潮湿空气中（90%RH）慢慢变干，可以获得最大孢子释放量。许多地衣，如Porpidia albocaulescents， graphis cervina（Ahmadjian 1993），孢子在释放后很容易分散开来落在琼脂表面。这种情况下，很容易进行单孢子培养。然而在毛根石耳（Umbiliacaria vellea)和其他一些种类中，孢子却形成一个8孢或少于8孢的孢子团，在这些种类中单孢子分离就有些难度。Ahmadjian（1993）提出了孢子进一步分离的一些方法（如以下所要提到的微量吸管吸取法）。Yamamoto et al.（1998)发现许多地衣的孢子释放情况受到采集季节、存放温
13、度和存放时间的影响。通过对一些种类的实验可知，它们的孢子形成或多或少有着内部的节奏。对一些温带地衣来说，春夏季是孢子释放的最佳季节。但是，在加拿大采集的石耳属（Umbilicaria)孢子却在夏季很容易萌发。2.孢子萌发据Pyatt（1968）报道，有些孢子在释放后的24小时内很快就会萌发，而另外一些则需要花费45天才能萌发。对于大多数地衣来说，孢子在释放几天后就会萌发。在我们实验中，孢子萌发期约为散发后121天（见表2)。有些孢子也许在释放时就已萌发。Lawarey （1984）报道Cetraria ciliris的孢子在释放后的六周后才萌发。Roussard（1969）和Mathy Hod
14、er（1978）称许多孢子甚至在子囊内就萌发了。通常，壳状地衣的单细胞孢子比二孢子或多孢子萌发的要快。叶状和枝状地衣的孢子比壳状地衣的孢子萌发的要慢。有多核的砖壁型多孢子或单孢子则需更长时间萌发。孢子的萌发受到培养基组成、培养基初始pH值和培养温度的影响。实验中大部分种类的孢子均在pH为6、温度为15的普通琼脂培养基上萌发。Letharia的孢子不能在琼脂培养基上萌发，但可以在Gelrite 培养基上萌发。一些种类的孢子不能在麦芽酵母提取的培养基上萌发。许多Peltigera种类的孢子可以在添加了树脂的培养基上萌发，因为树脂可以吸收抑制孢子萌发的石炭酸（phenols）。3.培养基的改进通过对
15、氨基酸或其他含氮类物质形式存在的氮素利用的研究，所得出的结果各异，因而没有一个统一的结论。添加大部分氨基酸会促进共生菌的生长。只有半胱氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等，不会维持其生长。大部分己糖碳源也会促进其生长。麦芽糖、甘露糖和乳糖也可以促进其生长，而柠檬酸盐、醋酸盐、红藓醇（erythritol）、三糖类则是不理想的碳源（Ahmadjian 1967b；Hale 1983）。通过改变和改进碳源和氮源均可改变共生菌丝的形态和生理特点。各种地衣共生菌对VB1，和维生素H均有一定需求，有些仅对其中一种有需求。4.过滤膜的应用 共生菌丝可直接接种到琼脂培养基或滤膜上培养。过滤膜可用纤维素、醋酸和硝酸纤维脂类、玻璃纤维制成（Oliver et al. 1989, Honegger and Kutasi 1990）。采用滤膜的优点在于它可以容易的转移到新培养基上。5.液体培养基的应用若采用液体培养基进行浸润培养，需要经常更换培养基（Honegger an
