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1、实验二 动物蠕虫学粪便检查技术(二)一、实验目的及要求1、掌握动物蠕虫学常见的实验室粪便幼虫培养及检查技术。2、认识线虫幼虫和吸虫毛蚴等寄生虫幼虫的一般形态特征。二、实验器材载玻片，盖玻片，平皿，培氏皿，镊子，烧杯，塑料杯，塑料袋，漏斗，漏斗架，胶帽吸管，离心管，试管，玻璃棒，纱布，脱脂棉，粪筛，锦纶筛（260目/英寸），搪瓷缸，三角量筒，三角烧杯，胶塞，表玻璃，酒精灯，平底孵化瓶，贝尔曼氏装置（乳胶管二端分别连接漏斗和小试管），显微镜测微器（目镜测微尺、物镜测微尺），血球计数板，普通温箱，光学显微镜等。碘液，家畜新鲜粪便等。三、实验方法、步骤和操作要领（幼虫培养法、毛蚴孵化法、幼虫分离法、寄
2、生虫学测微法）（一）幼虫培养法（Technique for the Culture of Third-stage Larvae）圆线目中有很多线虫的虫卵在形态结构上非常相似，、难以进行鉴别。有时为了进行科学研究或达到确切诊断目的，可进行第三期幼虫的培养，之后再根据这些幼虫的形态特征进行种类的判定。另外，做人工寄生性线虫感染试验时，也要用到幼虫培养技术。 (图2-1)幼虫培养的方法很多，这里仅介绍最简单的一种。即：取新鲜粪便若干，弄碎置培养皿中央堆成半球状，顶部略高出，然后在培氏皿内边缘加水少许（如粪便稀可不必加水），加盖盖好使粪与培氏皿接触。放入2530的温箱内培养（夏天放置室内亦可）。每日观
3、察粪便是否干燥，要保持适宜的湿度。约经715天，第三期幼虫即可出现（Egg-L1-L2-L3），它们从粪便中出来，爬到培氏皿的盖上或四周。这时，我们可用胶帽吸管吸上生理盐水把幼虫冲洗下来，滴在载玻片上覆以盖片，在显微镜下进行观察。图2-1 马属动物圆线虫第三期幼虫1. 马圆线虫 2. 普通圆线虫 3.无齿圆线虫 4.小型圆线虫培养幼虫时如无培氏皿，可用一大一小二个平皿来代替，将小平皿（去掉盖）加上粪便放于大平皿中央，大平皿内加少许水，然后用大平皿盖盖上，即可进行培养。也可用两个塑料杯来培养幼虫，效果更好。即先将一个塑料杯（上大下小）一截为二，较小的底部用针扎许多小孔，装满待培养粪便，上用双层纱
4、布蒙上，再把截下的那部分套上（头向下），使纱布绷紧；然后在另一个塑料杯内加少量水，把需培养的粪便杯套在该杯上（纱布面朝下），外面套上塑料袋进行培养即可。培养好后，用幼虫分离法分离幼虫。即把装粪便的小杯放在分离装置的漏斗上（用三角量筒也可），同时把塑料杯内的水也倒入（用水冲洗几次）。注意在放培养物时务必小心，不要使粪便散开。（二）毛蚴孵化法（Miracidum Hatching Method）毛蚴孵化法是专门用来诊断血吸虫病的，其原理是将含有血吸虫卵的粪便在适宜的温度条件下，进行孵化，等毛蚴从虫卵内孵出来后，借着蚴虫向上、向光、向清的特性，进行观察，做出诊断。方法有多种，如常规沉淀孵化法、棉析毛
5、蚴孵化法、湿育孵化法、塑料杯顶管孵化法、尼纶筛网集卵孵化法等，这里只介绍其中两种方法。(图2-2) 图2-2 塑料杯顶管装置及尼纶筛网示意图 1常规沉孵法（又称沉淀孵化法或沉孵法）。 取粪便100g，放入搪瓷缸内捣碎。加水约500 ml，搅拌均匀，通过粪筛滤入另一个容器内，加水至九成满，静置沉淀，之后将上清液倒掉 ，再加清水搅匀，沉淀。如此反复34次。第一次沉淀时间约为30分钟左右，以后20分钟即可。最后将上述反复淘洗后的沉淀材料加30的温水置于三角烧杯中，瓶口用中央插有玻璃管的胶塞塞上（或用搪瓷杯加硬纸片盖上倒插试管的办法）。杯内的水量以至杯口2cm 处为宜，且使玻璃管或试管中必须有一段露出
6、的水柱，之后放入2530的温箱中孵化。半小时后开始观察水柱内是否有毛蚴；如没有，以后每隔1小时观察一次，共观察数次。任何一次发现毛蚴，即可停止观察。(图2-3)图2-3 沉孵法装置示意图(引自Yang, 2005)毛蚴似针尖大小的白色虫体，在水面下方4cm 以内的水中作快速平行直线运动，或沿管壁绕行。可疑时，可用胶帽吸管吸出在显微镜下观察。有时混有纤毛虫，其色彩也为白色，须加以区别。小型纤毛虫呈不规则螺旋形运动或短距离摇摆；大型纤毛虫（体大、呈透明的片状）呈波浪式或翻转运动。(图2-4)A B C 图2-4 血吸虫虫卵及毛蚴A.东毕吸虫虫卵 B. 日本血吸虫虫卵 C. 日本血吸虫毛蚴1.原肠
7、2.头腺 3.侧穿入腺管 4.烟细胞 5.神经结 6.肠细胞 7.纤毛 8.排泄孔也可用锦纶筛（筛绢孔径为260目/英寸）集卵的办法来取代上述的反复水洗沉淀过程，对洗后所剩的粪渣再进行孵化。12342.棉析毛蚴孵化法（简称棉析法）。 取粪便50g，经反复淘洗或锦纶筛淘洗后（不淘洗也可），将粪渣移入300ml的平底孵化瓶中，灌注25的清水至瓶颈下部，在液面上方塞一薄层脱脂棉，大小以塞住瓶颈下部不浮动为宜，再缓慢加入20清水至瓶口13mm处。如棉层上面水中有粪便浮动，可将这部分水吸去再加清水。然后进行孵化。(图2-5)图2-5 棉析法装置示意图1.水平面 2.棉花 3.浊水层 4.粪渣这种方法的优
8、点是粪便只需略微淘洗或不淘洗就可装瓶孵化，毛蚴出现后可集中在棉花上层有限的清水水域中，可和下层混浊的粪液隔开，因而便于毛蚴的观察。（三）幼虫分离法（Baermanns Technique）本法又称为贝尔曼氏法。主要用于生前诊断一些肺线虫病。即从粪便中分离肺线虫的幼虫，建立生前诊断。也可用于从粪便培养物中分离第三期幼虫或从被剖检畜禽的某些组织中分离幼虫。(图2-6)图2-6 贝尔曼氏幼虫分离装置示意图操作方法：用贝尔曼氏装置进行。即用一根乳胶管二端分别连接漏斗和小试管，然后置漏斗架上，通过漏斗加入40的温水，水量约达到漏斗中部。之后漏斗内放上置有被检材料的粪筛。静置1小时后，拿下小试管，吸弃掉上
9、清液，吸取管底沉淀物，进行镜检。 也可以用简单的平皿法来分离幼虫；即取粪球310个，置于放有少量热水（不超过40）的表玻璃或平皿、培氏皿内，经1015分钟后，取出粪球，吸取皿内的液体，在显微镜下检查幼虫。（四）寄生虫学测微法（Micrometry in Parasitology）图2-7 显微镜测微器构造示意图 显微镜测微器是在光学显微镜下测量细菌、细胞、寄生虫卵、幼虫、某些成虫、原虫等大小的仪器。它由二件组成：一是目镜测微尺，一是物镜测微尺。目镜测微尺为一圆形小玻璃片，使用时装在目镜里。它的中央刻有100等分的小格，每5个和10个小格之间有一稍长线或长线相隔。这些小格在镜下并没有绝对长度的意
10、义，是随着目镜和物镜倍数的不同和镜筒的长短而变化的。因此，在测量前须用物镜测微尺在各种不同放大倍数的目镜和物镜的搭配下测出目镜测微尺每一刻度的绝对值。物镜测微尺为一个特制的载玻片，其中央有一黑圈（或是一个圆玻璃片，上有黑圈），在圈的中间有一长为1mm横线，被平均分成100格，每5格和10格之间有一稍长线或长线相隔。每格为0.01mm或10，这是绝对长度。(图2-7)。使用时，将目镜测微尺放于接目镜内，物镜测微尺放在载物台上。然后用低倍镜调节焦距，使目镜测微尺和物镜测微尺的零点对齐，再寻找目镜测微尺和物镜测微尺较远端的另一重合线，算出目镜测微尺的几格相当于物镜测微尺的几格，从而计算出目镜测微尺上
11、每格的长度，以后测量时，只用目镜测微尺量度就可以了。为了便于计算，可将目镜测微尺在固定显微镜和固定倍数物镜下的09格的长度事先计算好，列于卡片上，具体测量时，一查便知。在没有物镜测微尺时，可以用血球计数板代替使用。以该板内1个小方格的长度为标准，即可按上述方法测出目镜测微尺每1格的微米数。用目镜测微尺测量虫卵大小时，一般是测量虫卵的最长和最宽处，圆形虫卵则是测量直径；测量幼虫和某些成虫时，是测量虫体的长度、宽度及各部构造的尺寸大小；虫体弯曲时，可通过旋转目镜测微尺的办法，来进行分段测量，最后将数据加起来即可。(图2-8)图2-8 测微尺测量虫卵示意图（引自Thienpont et al, 19
12、86）四、实验注意事项1幼虫培养法。如果是为了研究某种蠕虫卵或幼虫的生物学特性，那就必须先将患畜粪便用蠕虫卵检查法或蠕虫幼虫检查法加以处理，然后将同种的虫卵或幼虫搜集在一起，放于培氏皿内，在2530的温箱中进行培育。培氏皿内须预先放好培养基。对于吸虫卵、绦虫卵、棘头虫卵和大多数线虫卵，可用水或生理盐水做培养基。最好的培养基是灭菌的粪便或粪汁，尤以后者为佳。因为用粪汁培育虫卵或幼虫时，可以直接将培育有虫卵或幼虫的平皿放于显微镜下，观察虫卵或幼虫的发育情况。粪便和粪汁的灭菌方法是100的温度下煮沸两小时。粪汁接种虫卵或幼虫之前，须先用棉絮过滤。2毛蚴孵化法。被检粪便务必新鲜，不可触地污染；洗粪容器
13、不宜过小，免得增加换水次数，影响毛蚴早期孵出；换水时要一次倒完，避免沉淀物翻动。如有翻动，须等沉淀后再换水；孵化用水一定要清洁，自来水须放置过夜脱氯后使用，所有与粪便接触过的用具，须清洗后再沸水烫泡，方可再用。另外多畜检查时，需做好登记，附好标签，以免混乱。3幼虫分离法。凡是检查组织器官材料，应尽量撕碎；但检查粪便时，则将完整粪球放入，不必弄碎，以免渣子落入小试管底部，镜检时不易观察；温水必须充满整个小试管和乳胶管，并使其浸泡住被检材料（使水不致流出为止），中间不得有气泡或空隙；为了静态观察幼虫形态构造，可用酒精灯加热或滴入少量碘液，将载片上的幼虫杀死后进行观察。4寄生虫学测微法。注意某个显微
14、镜测出的目镜测微尺每格的长度只适用于该显微镜一定的目镜倍数和一定的物镜倍数。更换其中任一因素，其每格的长度必须重新测量换算。此外，如需要用油镜时，必须在物镜测微尺上加盖玻片后再测量，以免损坏格线。五、实验报告1记录上述各种粪检技术结果，并对相关方法做简要叙述和概括总结。2绘出一个线虫三期幼虫形态图，并注明其各部构造名称。附：参考资料 1网尾线虫、原圆线虫和后圆线虫第一期幼虫的形态区别。家畜肺线虫中网尾线虫、原圆线虫和后圆线虫第一期幼虫的形态区别主要是根据其大小、头钮的有无、及尾部的形态特点和背刺的有无来进行区别。(表2-1) (图2-9)表2-1 家畜肺线虫第一期幼虫的鉴别特征（Yang, 2004）项 目网尾线虫幼虫原圆线虫幼虫后圆线虫幼虫大小0.320.56mm0.250.32mm虫卵呈椭圆形，外膜不平滑，表面有细小的乳突状突起，卵内含有发育的幼虫。头钮丝状网尾线虫：有胎生网尾线虫：无无尾部丝状网尾线虫：较钝，不呈波状胎生网尾线虫：较尖，呈波状较尖、平直或波状。背刺无原圆线虫：无缪勒线虫：有21
