《RT-PCR引物设计原则和方法.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RT-PCR引物设计原则和方法.doc（28页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、RT-PCR引物设计原则和方法在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Pa
2、rameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300500bp。点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括
3、：Tm应该在5570度之间，GC应该在4555间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜
4、索出的引物质量感觉不如Primer5。在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以
5、通过点击ChangeCurrent oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3端的Delta G。3端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结
6、构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。Analyz
7、e中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC需要控制在4060，而且上下游引物之间的GC不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、GC method和2(AT)4(GC)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在5070度之间。第五项为Fals
8、e Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使错误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注
9、明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。引物评价完毕后，可以选择FilePrint，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。有一个问题，引物设计原则里面常常强调，引物所对应模板序列的Tm 值最好在72左右
10、，但是软件里面Search出来的引物，很少有达到这个值的，一般都在5065度之间，这是什么原因？软件怎么没有限定这个规则？一、软件使用： 推荐软件：Primer Premier 5.0 优点：操作简单、显示各种参数改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等 缺点：没有明显缺点l 本地同类软件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar；DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada).网上同类软件：Primer3（Whitehead Institute 开发）；JaMBW（European Mole
11、cular Biology Laboratory of Heidelberg 开发）。http:/210.72.11.60网站已引进并调试好这两种软件。独特之处在于：对全基因组PCR的引物设计，可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。引物设计专栏：http:/ 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。引物设计原则引物长度 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR
12、时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。碱基分布的均衡性同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般40-60%GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。引物Tm值一般要求：55-65。计算：对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15引物二级结构引物二聚
13、体尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。引物3端引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物5端引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物
14、素、地高辛等）。引物的内部稳定性过去认为，引物3端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3端最好为G或C。现在的观点认为，引物的5端应是相对稳定结构，而3端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3端尽可能选用A或T，少用G或C。仅仅3端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。如果3端为富含G、C的结构，只需3端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。引物的保守性与特异性保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增扩增区域的二级结构模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域
15、。扩增区域的自由能（G。）小于58.61kJ/mol引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30Tm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length 引物与PCR引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L引物浓度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2OVH2O (单位：L)退火温度最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of product) 25一般采用较引物Tm值低5作为PCR退火温度。引物设计软件Primer Premier 5.0 生物软件网下载安装
