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1、1、广义的发酵概念为：借助微生物大量生成并积累特定的代谢产物的现象。微生物工程学是以微生物学、生物化学和生物工程学为基础，又与工程技术紧紧联系在一起而建立的一个完整的科学与工程技术体系。它是研究利用微生物（包括“工程微生物”在内）及其代谢产物与工艺生产过程原理的科学。2、微生物工程简史：孕育时期天然发酵、第一代微生物发酵技术纯培养技术的建立（人为控制发酵过程的时期）、第二代（近代）微生物发酵技术深层培养技术（抗生素工业生产）、第三代微生物发酵技术微生物工程（主流发展方向“工程菌”）。3、微生物代谢产物的类型：初级代谢产物（Primary metabolites）：微生物通过代谢活动所产生的、自
2、身生长和繁殖所必需的物质。次级代谢产物（Secondary metabolites）：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。转化产物：以外源物质为底物，通过微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应，使它转变成结构相类似但更具有经济价值的化合物。4、微生物工程面临的问题菌种问题、合适的反应器、基质的选择5、微生物工程发展的趋向提高现有微生物发酵工业水平、利用重组DNA技术、开拓极端酶1、微生物特点：体积小、比表面积大；生长快、繁殖性强；适应强、多变异。2、对工业菌种的要求生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代
3、谢产物的产量高，其它代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，不易变异退化安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素3、常用工业微生物菌种及主要代表产物。（1）革兰氏阴性无芽孢杆菌A、大肠埃希氏菌（俗称大肠杆菌）可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等。大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸的定量分析。基因工程研究材料。B、醋酸杆菌 可生产醋酸；有机酸 ；制备葡萄糖异构酶；生产山梨糖，好气性C、假单胞菌 多数种能氧化葡萄糖、分解蛋白质和利用无机氮；好氧菌；生产维生素c 、生产抗生素 、制备多种酶、生产酶抑制剂、生产有机酸。（2）革兰
4、氏阳性无芽孢杆菌A、短杆菌发酵生产多种氨基酸 如Glu、Thr、Met。发酵生产核苷类产物 如ATP。B、棒状杆菌高产谷氨酸及多种氨基酸，可分解土壤中2，4-D类除草剂。C、乳酸杆菌：德氏乳酸杆菌、保加利亚亚种（与嗜热链球菌混合）、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌工业生产乳酸；发酵生产乳制品；生产药用乳酸菌制剂；生产禽畜益生菌制剂。（3）革兰氏阳性芽孢杆菌A、枯草芽孢杆菌在酱油、酱类和白酒制曲时，如果水分含量大，温度较高，就容易造成枯草杆菌迅速繁殖；不仅消耗原料蛋白质和淀粉，而且生成刺眼鼻的氨味，造成曲子发粘发臭，使制曲失败；能产生大量淀粉酶和蛋白酶；可发酵生产核苷，生产某些抗生素、多肽、蛋白质类药物和
5、酶 。 B、丙酮丁醇梭菌专性厌氧,生产丙酮丁醇；生产丁酸或己酸，在传统的大曲酒生产中赋予白酒浓香型香味成分。（4）放线菌A链霉菌属灰色链霉菌：链霉素 ；龟裂链霉菌：氧四环素(也称土霉素) ；金霉素链霉菌：金霉素(氯四环素) ；红霉素链霉菌：红霉素。B、小单孢菌属：庆大霉素。C、游动放线菌属：创新霉素。D、诺卡氏菌属：利福霉素、蚁霉素。 E、孢囊链霉菌属： 多霉素、孢氯霉素、西伯利亚霉素。（5）蓝细菌A、固氮作用绿肥。B、作为食物和营养品：发菜念珠蓝细菌、普通木耳念珠蓝细菌、螺旋蓝细菌、螺旋藻产品。C、用于提取各种生物药物。（6） 酵母菌单细胞真核，主要分布于含糖质较多的偏酸性环境中。A、 啤酒
6、酵母a、根据长与宽的比例，分三组：长宽比为12主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包用；长宽比为2多供生产葡萄酒、果酒用；长宽比大于2耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用；b、啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类：上面酵母发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面下面酵母发酵度较低，易凝集沉淀（主要用于啤酒发酵）B、卡尔斯伯酵母：与酿酒酵母相似，主要的区别在于卡尔斯伯酵母能发酵棉子糖和蜜二糖。卡尔斯伯酵母常用于啤酒酿造的底层发酵，也可食用、药用或作饲料。C、汉逊酵母：此属酵母多能产生乙酸乙酯，但由于它能利用酒精作碳源，又能在饮料表面产生干皱的菌膜，所以又是酒精生产的有害菌。D、球拟酵母：此属酵母有些种能产
7、生不同比例的甘油、赤藓糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。E、假丝酵母：能形成假丝，液体培养时能形成浮膜；可生产SCP、甘油、脂肪酶；处理工业和农副产品加工业的废弃物。F、红酵母：有明显的红色或黄色色素，很多种因生荚膜而形成粘质状菌落；可由菌体提取大量脂肪、贝特-胡萝卜素。G、棉病针孢酵母：又名棉病囊霉，能危害许多重要的经济作物，如棉花、柑橘、番茄等；该菌具有大量合成核黄素的能力，是核黄素生产的重要菌种。H、毕赤氏酵母：能利用石油或农副产品及工业废料产生菌体蛋白，有些菌株能生产麦角固醇、苹果酸、磷酸甘露聚糖。（7）霉菌A根霉a、 米根霉：淀粉酶活力极强，多作糖化酶使用；又由于具有较强的蛋白
8、质分解能力，也可用于制造腐乳。b、 华根霉：是酿酒所必须的重要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌种。B、毛霉a、 总状毛霉：可制作豆豉。b、 鲁氏毛霉：从我国小曲中分离出来；能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，常用来制作腐乳。C、曲霉a、米曲霉：酱油和酱类。b、黄曲霉：液化型淀粉酶。c、黑曲霉：是生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种。 d、栖土曲霉：为蛋白酶生产菌种。D、青霉a、产黄青霉：青霉素、葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸等；b、桔青霉：可产脂肪酶、葡萄糖氧化酶和凝乳酶；c、木霉：产纤维素酶及抗生素等药物d、犁头霉：对甾族化合物有较强的转化能力 e、紫
9、红曲霉：食品及饮料的着色剂，用红曲配制红酒、玫瑰醋、红腐乳 f、产黄头孢霉：头孢菌素N及头孢菌素C（先锋霉素） 4、分批培养：是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定条件下完成一个生长周期的微生物培养方法连续培养：是以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液量维持恒定，使微生物能在接近恒定状态下生长5、培养方法（1）固体培养A、实验室常见的固体培方法：琼脂1.5%-2.0%B、生产中常见的固体培养基：小麦麸皮（2）液体培养（liquid-state culture）A、实验室常见的液体培
10、养试管液体培养；浅层液体培养；摇瓶培养；发酵罐培养B、生产中常见的液体培养浅盘培养；发酵罐深层培养；连续培养；补料分批培养；混合培养浅盘培养：容器中盛装浅层液体静置培养无搅拌设备，全靠液体表面与空气接触进行氧气交换。劳动强度大效率低易感染。其中连续培养包括：恒化培养：通过控制培养基中营养物的浓度，使微生物在低于最高生长速率的条件下生长繁殖。 恒浊培养：可控制微生物在最高生长速率与最高细胞密度的水平上生长繁殖，达到高效率培养的目的。 多级连续培养。固定化细胞连续培养分离（separation）：是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开来，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方
11、法对它们进行分离、筛选，最后得到所需的菌株。1、分离的基本程序* ：采样富集分离筛选鉴定（1）采样对象：以采集土壤为主。一般田园土、耕作土和近郊土壤中的有机质含量丰富，营养充足，适合于细菌和放线菌生长；森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿,适合酵母和霉菌生长繁殖；采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-25cm处的土约10g（北方土壤干燥，可在1030cm处取样）。记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。（2） 富集培养enrichment culture：是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性
12、培养基（投其所好、取其所抗的原则），创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速的生长繁殖，数量增加，在原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。A控制营养：在富集培养基中加入相应的底物作为唯一碳源或氮源。B控制培养条件：控制pH、温度及通气量。C抑制不需要的菌类：通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量。（在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性：如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素；分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等）（3） 分离方法：菌落纯，粗放：稀释涂布法、划线分离法、组织分离法等。菌株纯、细胞纯，单细胞或单孢子分离方法。A常规
13、分离法：涂布法和划线法。B生化反应分离法*：透明圈法、变色圈法、抑菌圈法和生长圈法。C通过控制营养和培养条件进行分离：调解营养成分、pH，控制培养温度，抑制杂菌。D环保降解菌的分离：连续富集培养水解圈或变色圈法。透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基浑浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力主要用于分离水解酶产生菌：淀粉酶、核酸酶、产有机酸的菌。变色圈法：在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。例筛选果胶酶产生菌：用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液
14、染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。又如分离解脂微生物豆油作底物，中性红（红黄. 6.88.0. ）指示，菌落周围呈红色圈。抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离筛选。工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。生长圈法：通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物质的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。（4） 微生物筛选和目的产物的鉴别初
15、筛：平板筛选；震荡培养筛选（1株接1瓶、1瓶1环）及平板活性测定琼脂平板透明圈法，斜面菌种，留下产量较高的10-20%菌株复筛（1株接35瓶 每瓶3-5%），每次保留10-20%直至最后3、5株野生型菌株（wild-type strain）：直接从自然界样品中分离出来、且经过初筛和复筛筛选得到的具有一定生产性能的菌株。例题：不同的微生物有各自的代谢特点，人们常据此来分离、鉴别微生物种类。某实验室有二个菌种，分别是胱氨酸依赖型细菌（无胱氨酸不能生长），甲基营养细菌（只能利用甲醇.甲烷作碳源），但试管上标签脱落，请根据它们的代谢特点设计实验方案加以鉴别。实验步骤：第一步：在二个菌种的试管上分别标上A.B第二步：配制不含胱氨酸、甲基营养(甲醇、甲烷)的普通培养基，分装到6只试管中，标号1、2、3、4、5、6； 在1、2中添加胱氨酸，3、4中添加甲基营养，5、6都不添加，一起灭菌。第三步：将A试管的菌接种在1、3、5号试管中，B试管的菌接种在2、4、6号试管中。置于适宜条件下培养数天。结果分析：在1、3、5试管中，若只有1试管有细菌生长，则A试管中的菌为胱氨酸依赖型细菌；若只有3试管有细菌生长，则A试
