《无溶剂体系中蛋白酶催化氨基酸糖酯合成研究.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《无溶剂体系中蛋白酶催化氨基酸糖酯合成研究.doc（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、无溶剂体系中蛋白酶催化氨基酸糖酯合成研究黄成红 马林*基金项目 中山大学化学与化工学院第三届创新化学实验基金项目（批准号：02005）资助第一作者 黄成红（1981年出生），女，中山大学化学与化工学院材料化学专业99级指导老师 马林(导师) Email：中山大学化学与化工学院，有机化学研究所，广州，510275摘要 在无溶剂体系中，糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与D-葡萄糖进行酯交换反应，结果表明是在6位伯羟基(6-OH)进行定位酰化。生成的氨基酸葡萄糖酯可通过HPLC-UV定性并定量检测,最适条件下的反应转化率达到90%以上。关键词 蛋白酶，无溶剂体系，糜蛋白酶，苯丙氨酸，葡萄
2、糖1 前言糖类是自然界广泛存在的一大类生物活性分子。近年来糖科学的发展，揭示了糖类在生命过程中起着重要作用，参与了许多生理和病理现象。在细胞表面的大量受体分子几乎都是糖蛋白或糖酯类糖链化合物，对生物信息的传递作用起着重要作用1。糖酯作为一种生物功能分子和化工原料具有重要价值,可用于医药、食品及高分子材料，具有其他单体无可比拟的优越性。已经合成并应用的糖酯多是高级脂肪酸糖酯、芳香酸糖酯，而氨基酸糖酯，除了甘糖酯已较为广泛的应用于医药外，其他还不多见报道。氨基酸及多肽作为另一大类生物活性分子，具有多种生理功能。我们试图将氨基酸及多肽的官能团引入糖类化合物，形成一类具有多种生理机能的氨基酸糖酯化合物
3、。但是氨基酸和多肽的化学合成，由于需要保护与脱保护，合成比较困难，为此Cerovsky等人用有机相酶催化反应，进行氨基酸糖酯合成的研究，反应转化率达到20-60%，并表明产物主要是6位氨基酸糖酯2。糖是极性化合物，需要选择强极性溶剂如吡啶、DMF等(或者将糖形成糖苷或其他衍生物以增加它在有机溶剂中溶解性) 3,4,而酶是水溶性的,不溶于有机溶剂,这就给有机溶剂中酶催化反应带来许多困难，而无溶剂条件下或超饱和体系中酶催化可以解决这些问题。为此我们用蛋白水解酶进行氨基酸糖酯的合成研究。糜蛋白酶是一种研究比较多的酶，有较好的催化活性，它能催化水解L型芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)所组成的
4、肽键、酰胺键和酯键5。用糜蛋白酶直接催化苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸与葡萄糖进行酯化反应,之后先将苯丙氨酸形成酯,再与葡萄糖进行酯交换反应，反应式如下（scheme1）：Scheme1 N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应2 实验2.1 仪器和材料78-1磁力加热搅拌器仪器，GKC-11R1型可控恒温水浴锅，SHZ-D循环水式真空泵，ZF-Z型三用紫外仪，HP1100型高效液相色仪，DAD检测器。N-叔丁氧酰基L-酪氨酸、N-叔丁氧酰基-L-赖氨酸、N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸均购于Sigma, Aldrich公司，蛋白酶购于日本化成工业株式会社，-糜蛋白酶、胃蛋白酶DMAP和DC
5、CI均为国产，其它试剂均为分析纯，购于广州化学试剂厂。2.2 实验方法2.2.1 蛋白酶催化氨基酸与葡萄糖的酯化反应将3种氨基酸：N-叔丁氧酰基L-酪氨酸、N-叔丁氧酰基-L-赖氨酸、N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸与3种蛋白酶：-糜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶适量交叉混合于9支小试管中，再加入葡萄糖和一定pH值的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液10l，搅拌均匀。和底物空白、酶空白一起密封置于45水浴中反应8天。取出用乙酸乙酯萃取后进行HPLC-UV检测。2.2.2 N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯的合成6按文献用DMAP和DCCI在二氯甲烷中催化脱水合成，产物用乙酸乙酯萃取并用饱和NaHCO3溶液
6、洗涤有机层，以无水Na2SO4干燥，有机溶剂在真空下抽干,得白色油状物。2.2.3 -糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应分别称取N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯(25mol)与硅藻土的混合物21.9mg和葡萄糖(0mg-9.9mg)于小试管, 再分别加入-糜蛋白酶(0-10mg)和一定pH值的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液(0l-20.0l)于小试管中，搅拌均匀。和底物空白一起密封置于45水浴中反应60-90小时。取出用乙酸乙酯萃取后进行HPLC-UV检测。3 结果与讨论3.1 蛋白酶催化氨基酸与葡萄糖的酯化反应氨基酸直接与葡萄糖在蛋白酶催化下进行酯化，反应效
7、果不好。相比之下，-糜蛋白酶在生理活性的pH值下催化效果比较好。胃蛋白酶在pH=1.5-2的酸性环境中催化活性会比较好。3种氨基酸的反应性没有明显差别，基本上都没有产物氨基酸糖酯，仅-糜蛋白酶催化的苯丙氨酸有极少量酯生成。3.2 -糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应 鉴于无溶剂体系中-糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸与葡萄糖的酯化反应效果较差，为此，我们合成了N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯，研究了-糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应。3.2.1 底物比对N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应的影响 图1 底物比
8、对反应的影响 一般在蛋白酶催化反应中排毒养颜胶囊，底物比为1时反应效果最好，并且可避免多酯及其它副产物生成。由图1可见，转化率在葡萄糖与N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯的配比为0.75左右最好。由于N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙醇酯是油状物，比较难抽干其中的水，所以葡萄糖与N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯的实际比接近1。 3.2.2 加酶量对N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应的影响 图2 加酶量对反应的影响 酶不会改变反应平衡，但可以加快反应速度，所以在一定时间内转化率随酶量增加相应增大。但由于加酶量大会增大工艺成本，我们往往权衡反应转化率、反应时间及工艺成本寻求一个比较合适
9、的加酶量。由图2可见，当底物量、 加水量及其它条件一定时，转化率随加酶量增加而增大，到一个最大值时又呈下降趋势。这可能因为水量一定，过多的酶争夺水分子，必然有一些水分子处于失活状态，导致反应体系中载体、底物和带结合水的活性酶分子不能均匀分散，使反应速度减小。这样痔疮偏方，一定时间内的反应转化率也就相应减小。 3.2.3 加水量对N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应的影响 酶催化反应中，酶只需少量结合水，-糜蛋白酶只需几十分子水既可以保持其构象以维持催化活性。多余的水一方面会使-糜蛋白酶失活，另一方面会导致氨基酸糖酯水解，蛋白酶在水溶液中是催化多肽和酯水解的。由图3可知，在未加水
10、时，依然有氨基酸糖酯生成，但转化率很低，只有10左右。当加水量增大时，转化率也随之增大，但副反应产物也增多。-糜蛋白酶与水的质量比为1：1较合适。 图3加水量对反应的影响 图4 pH值对反应的影响3.2.4 pH值对N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应的影响缓冲溶液的pH值主要会对酶活性中心的离子键、疏水作用及氢键有影响，并进一步影响其高级结构怎么减肚子。-糜蛋白酶的酶解作用是由三个活性中心协同完成的，而这三个活性中心又分别在两条链（B链和C链），所以pH值对其影响不可忽略，合适的pH值维持其高级结构是很重要的7。由图7可知，-糜蛋白酶的催化活性在pH值78时比较好，而在这个范
11、围附近，pH值对酶的催化活性影响并不是很大，pH=7.5时出现最大值。3.2.5 反应时间对N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应的影响由于无溶剂体系的反应在反应过程中没有搅拌，完全是靠自然扩散来完成，所以随着反应时间延长，反应的转化率增大。图5反映了反应时间对-糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应转化率的影响，图5(a)为未反应的HPLC-UV检测图，谱图上只有N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯的吸收峰。图5（b）为反应60小时的检测图，第一个峰为N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸葡萄糖酯的吸收峰，从峰面积可以看到反应的转化率在70左右。图5（c）为反应90
12、小时的检测图, 毛孔大怎么办反应基本完全，转化率达到90以上。(a) (b) (c)图5 反应时间对N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖的酯交换反应的影响4 结论N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯与葡萄糖在-糜蛋白酶催化下进行酯化反应效果不好，生成N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯后再与葡萄糖在-糜蛋白酶催化下进行酯交换反应，反应的转化率提高。这与-糜蛋白酶的催化机制有关，His-57的残基咪唑基是一个高效的质子受体与给体，它能接受Ser-102残羟基的质子，使Ser-102形成一个高度极化亲核基团，利于和底物的亲电基团结合。而直接用氨基酸，氨基酸羧基上的质子则可能与Ser-102的残羟基竞争
13、，影响活性中心的协同作用机制。另外，酶催化反应受多种因素影响，我们通过一系列的条件实验，以寻找反应的最佳条件。理想的无溶剂催化反应中，两种底物的分子等量、均匀的分布，单分子层排列在每个载体分子周围。载体表面形成的产物分子层可以及时离开，其它底物分子又扩散到载体分子表面。这样在没有搅拌的情况下，酶分子可以通过自然扩散，以最大的反应速度催化反应完成。致谢 我衷心感谢马林教授岳阳家政、古练权教授和黄志纾副教授的悉心指导，徐迪师姐的细心指导及实验室各位师兄师姐的支持与帮助，和黄仲立老师为我们提供的高效液相检测。参 考 文 献1郭勇.生物制药技术.第1版.北京：中国轻工业出版社.2000：34.2Oh-
14、Jin Park, Gyu-Jong Jcon, Ji-Won Yang. Protease-catalyzed synthesis of disaccharide amino acid ester in organic media, Enzyme and Microbial Technology 1999,25,455-4623Therisod M., Klibanov A.M.J. AM. Chem. Soc.,1986.108:56384Joel Chopineau, Frank D. McCalferry, Sergio Riva, Biotechnol. & Bioeng.,1988
15、.31:2085蒋传葵，金承德，吴仁龙等.工具酶的活力测定.第1版.上海：上海科学技术出版社，1982：1016Madhud K. Dhaon,Richard K. Olsen, and K. Ramasamy. Esterfication of N-protected -amino acids with alcohol/carbodiimide/4-(dimethylamino)-pyridine. Racemization lf Aspartic and glutamic acid derivatives, J.Org.Chem.1982,47,1962-19657张玉彬.生物催化与手性合成.第1版.北京：化学工业出版社，2002：16Protease-
