芦丁的提取分离和鉴定

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1、综合化学实验:芦丁的提取分离和鉴定芦丁简介:芦丁（Rutin）又名芸香苷化学式：C27H30O163H2O,是一种浅黄2730162色针状结晶有机化合物,广泛存在于自然界植物中,是一种被人们广 泛使用的有机天然产物。目前已发现含有芦丁的植物至少在70 种以 上,常见的如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均有不同含量。尤其以中 药槐米（豆科、槐属,槐树 Sophora japonica 的花蕾）和荞麦中含 量最高,因此槐米可作为大量提取芦丁的天然植物原料。中药槐米（炒碳）味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治 疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢 等。西医研究其主要有效成分为有

2、机化合物“芦丁”而中药槐米中芦 丁的含量可高达 1216%,是主要的芦丁天然来源。槐米中还含有槲 皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。研究文 献证明芦丁具有VitP （维生素P）样作用（VitP具有生物类黄酮的功 能,可防止维生素 C 被氧化而受到破坏,增强维生素功效；增加毛 细血管壁强度,防止瘀伤。有助于牙龈出血的预防和治疗,有助于因 内耳疾病引起的浮肿或头晕的治疗等）。而芦丁具有类似作用如可降 低毛细血管脆性和调节通透性等,在医学临床上常将其用作毛细血管 脆性引起的出血症以及防治高血压病等的辅助治疗药物。芦丁是由槲皮素（quercetin）3位上的羟基与芸香糖（rutin

3、ose, 一种由葡萄糖 glucose 与鼠李糖 rhamnose 组成的双糖）脱水合成的 苷,是一种浅黄色粉末或极细的针状结晶,含有三分子的结晶水,熔 点为174178 C,无结晶水时188190 C。溶解度：冷水中为 1 :1 0000；热水中1 :200；冷乙醇1 :650；热乙醇1 :60；冷吡啶1 :1 2。 微溶于丙酮、乙酸乙酯,不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚,溶于碱而 呈黄色。补充知识:关于苷（gn）和甙（dai）:苷类（glycosides,旧称甙）又称配糖 体，是糖或糖的衍生物的半缩醛羟基与另一类非糖物质中的羟基以缩 醛键（甙键）脱水缩合而成的环状缩醛衍生物,水解后能生成糖与非

4、 糖化合物。目前国际上通用“苷”如“皂苷”,而过去习惯使用的中文名 称“甙”目前已不再使用如“皂甙”现统称“皂苷”。一、目的要求：1通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。2、掌握化学鉴别试验、苷水解、衍生物制备、熔点和薄层层析检测等手段 在苷类结构鉴定上的作用。3、通过 UV、IR、HNMR 和 MS 图谱解析,了解光谱方法黄酮类化合物结 构鉴定中的作用。已知重要成分性质1. 芦丁（rutin）：分子式C27H30O16 3H2O,为浅黄色针状结晶物，mp174178C （含三分子水）；100mmHg和110C加热12小时后，变为无水物，115117C软化，214215

5、C发泡分解。难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙 酮、二硫化碳、苯等，易溶于吡啶，甲酰胺特别是碱液。通常常用的溶剂下其溶 解情况为：较难溶于冷水（1： 800010000），冷乙醇（1： 650）；可溶于热水（1： 180200）以及冷甲醇（1： 100）；较易溶于热乙醇（1： 60）和热甲醇（1： 10）。2. 槲皮素（quercetin）为芦丁的苷元其分子式为：C15H10O7 2H20，黄色结晶， mp313314C（2分子结晶水），316C（无水物）。能溶于冷乙醇（1： 290），易 溶于沸乙醇（1： 23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于 水、苯、石油醚等溶

6、剂。一般在碱水中溶解显黄色。R=glu一 rha芦丁R= OH槲皮素3.皂苷(saponin) 般为白色粉末，mp 210C220C。易溶于吡啶。能溶于 甲醇(1：200)，可酸水解得下列两种苷元及糖。糖为葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡 萄醛酸内酯。(1) 白桦酯醇(betulin)无色针晶，mp215220C，能溶于醋酸，丙酮、 醋酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、苯等；难溶于石油醚和水。(2) 槐花二醇(sophoradiol)无色针晶,mp219224C，溶于石油醚、苯、 丙酮、甲醇、难溶于水。芦丁属于黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，因此可溶于稀碱液中，在酸 液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利

7、用芦丁易溶热水、热乙醇，较难 溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。芦丁可被稀酸水解生成槲皮 素及葡萄糖、鼠李糖，依此进行制备槲皮素。通过纸色谱及紫外光谱等可进行黄 酮及糖的鉴定。芦丁酸性条件下水解的过程见下反应方程式：H00HH0.000H0Hch30 0HOH OH 0 |OHH+ H水解OH +鼠李糖+葡萄糖OH 0斛皮袤三、提取分离和纯化槐花米粗粉 25g碱提取在30伽境押中加入水25Dmb硼砂ig（注1莊加热至沸腾时，投入槐花米 继续直火煮沸直盼钟，在搅拌下中心加入石灰乳，调至吐刊注21保持 黴沸3Q井钟，趁熬用尼龙布挤过谑。滤渣谑液-n、宀在GD-7D匸下用浓盐酸调pH至主

8、环静置b时 以,上析出沉淀。抽滤，用蒸憎水洗沉淀1欠至中 性。滤酒沉淀芦丁粗品（笄去）粗称重后按芦丁在热水中1 : 200的濬解度扣萎憾水进行重结晶将沉淀悬浮于萎馆水中 加热煮沸1盼钟，趁热过滤。滤渣（笄去）滤液充分静置，过滤，60-70匚干燥，称重芦丁（精制品）注1：硼砂因能与芦丁结合，起保护邻二酚羟基，不被氧化破坏的作用，实验证明，提取时加入硼砂，产品质量要好些。注 2：加石灰乳既能达到碱溶解提取芦丁的目的，还可以除去槐花米中大量 的粘液质和酸性树脂（形成钙盐沉淀），但 pH 不能过高和长时间煮沸，因为会 导致芦丁的降解。注 3： pH 过低会使芦丁形成锌盐而降低收率。、芦丁的鉴定定性反应

9、鉴别见附录。一）芦丁的酸水解称取精品芦丁 2 g置500ml烧瓶中加 2% 的 H2SO4 200ml加热回流1小时 放冷，静置，抽滤酸性滤液沉淀中和中性滤液冷水洗两次，干燥用95%乙醇25 ml重结晶 ，结晶时可加入冷水20 ml 最后称重，计算收率。浓缩浓缩液黄色细针状结晶（槲皮素）供糖的鉴定）（二）糖的鉴定（纸色谱法）纸层析鉴定：采用中速层析滤纸（裁剪尺寸：5X20 cm）取水解母液20 ml, 于水浴上加热，同时于搅拌下加BaCO3细粉中和至中性，过滤去多余BaCO3 后, 滤液浓缩至23 ml,得样品液供纸色谱点样用。标准对照品：以葡萄糖和鼠李糖标准品作对照（1葡萄糖标准品醇溶液及

10、1鼠李糖标准品醇溶液）。展开剂：正丁酵-醋酸-水（BAW） （4： 1： 5） 上层，悬挂并利用上层展开剂 纸色谱分离。显色剂：苯胺以及邻苯二甲酸混合试液，喷后105C烘10分钟。显棕红色 斑点。注意事项: 纸层析展开时可事先用铅笔在裁剪好的层析纸上画出展开起点 （即点样的位置）和预制终点（即展开完毕后展开液的前沿），这样方便进行测量计 算比移值。另外由于糖液一般无色，因此点样位置也可事先用铅笔点出标记，注 意如果糖液浓度过低（实验时应尽量将糖液蒸发浓缩至 3 毫升以内）则应多次点 样以达到浓集的目的，否则展开后的点不够明显。点样时也需要注意点样液斑不 易扩散太大，应控制液斑直径在3 mm以内

11、，同时各点样点之间应尽量保持距离 不可过于靠近，否则展开后可能得到较大的样班，而且不同样斑之间可能重合相 互干扰而不易测量比移值。下图给出正确的纸层析法标示。展幵剂下层（三）芦丁和槲皮素的薄层层析鉴定吸附剂：硅胶G （400目）以0.4 %羧甲基纤维素钠（CMC-Na ）水液作为 粘合剂制薄层层析板，板片自然阴干后于烘箱中100 C活化1小时。展开剂：（1） CHCl3-MeOH-HCOOH（15：5：1）（2） CHC13-丁酮-HCOOH （5： 3： 1）显色剂：1%的FeC13和1%的K3Fe （CN） 6水溶液，使用时等体积混和。注意：薄层层析点样注意事项依照纸层析五、实验说明及注意

12、事项1. 用石灰水调节芦丁提取溶液的pH,既可以达到碱提取芦丁的目的，还可 以除去槐米中含有的大量粘液质。但钙离子浓度及pH值均不宜过高，否则多余 的钙能与芦丁形成螯合物沉淀，同时黄酮结构在强碱性条件下易被破坏。2. 调PH时，应注意PH不要过低，因为PH过低（pH 2以下）会使芦丁形 成钅羊盐而使已形成的沉淀重新溶解，同时黄酮母核也会在强碱性条件下被破 坏，导致收率下降。3. 注意观察槲皮素制备过程中的实验现象。六、思考题1 .苷类结构检识的一般程序？2. 苷类水解的催化方法？3. 怎样确定芦丁结构中糖基是否联结在槲皮素3-O位上？4. 怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖及一个鼠李糖？5.

13、UV 在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。附录：芦丁的定性检测1芦丁的定性反应 取芦丁适量，加乙醇使溶解，分成三份供下述试验用：(1) 盐酸镁粉试验：取样品液适量，加2滴浓HC1、再酌加少许镁 粉，即产生剧烈的反应，并逐渐出现红色至深红色。(2) 锆-枸试验：取样品液适量，然后加2%ZrOCl2的甲醇溶液， 注意观察颜色变化，再加入 2枸椽酸的甲醇溶液，并详细记录颜色 变化。(3) a-萘酚-浓硫酸反应：取样品液适量，加等体积的10%a-萘酚 乙醇溶液，摇匀，沿管壁缓加浓硫酸，注意观察两液界面的颜色。2芦丁的 UV(1) 鉴定试剂的配制 甲醇钠溶液：取0.25g金属钠，切碎，小心加入色谱甲醇10

14、ml中，此液置于玻璃瓶中，用橡皮塞密封。 三氯化铝溶液：取1g无水三氯化铝，小心加入色谱甲醇20 ml 中，放置 24 小时后全部溶解即得。 醋酸钠：用无水粉末醋酸钠。硼酸饱和溶液：取无水硼酸，加入适量色谱甲醇、制成饱 和溶液。(上述贮备液可放置六个月)(2) 芦丁溶液的配制精密称取芦丁纯品0.5g，用甲醇适量溶解至50 ml容量瓶中，用 甲醇稀释至刻度。(3) 光谱的测定 甲醇光谱：取样品液置石英杯中，至200500 nm内进行扫 描，重复一次，观察紫外光谱。 甲醇钠光谱:取样品液置石英杯中，加入甲醇钠溶液3滴后， 立即测定，放置5 分钟后再测一次。 三氯化铝光谱，在盛有样品液的石英杯中，加

15、入三氯化铝6 滴，放置1分钟后进行测定。测定后加入3滴盐酸溶液（盐酸：水= 1：1）再进行测定。 醋酸钠光谱:取样品液约3 ml，加入过量的无水醋酸钠固体, 摇匀（杯底剩有约 2 mg 的醋酸钠），加入醋酸钠后两分钟内测定， 5 分钟到 10 分钟后再测定一次。3芦丁及槲皮素的色谱支持剂：中速层析滤纸（5x20 cm） 展开剂：正丁醇-醋酸-水（4： 1： 5）上层 样品：自制槲皮素的乙醇溶液自制芦丁的乙醇溶液对照品：槲皮素标准品的乙醇溶液芦丁标准品的乙醇溶液 显色剂：三氯化铝乙醇溶液喷雾预习报告及实验报告格式和要求：预习报告：1、实验目的2、实验原理3、实验步骤：（1）要求将实验内容分拆，并画出流程图（2）要求写明各试剂的用途和各步骤的目的和实验原理4、回答指导教师提出的问题实验报告：实验报告一律每班用一样大小软皮本，正面写实验报告，背面写 实验记录，上课前交预习报告和上一次的实验报告（预习报告和 实验报告写一份即可）。组号 同组人 （预习报告完成）天气情况 实验室温度 湿度