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1、三、核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法50TAE Buffer (pH8.5)组份浓度 2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中。Tris242 gNa2EDTA2H2O37.2 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加入57.1 ml的乙酸，充分搅拌。 4.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。10TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度 890 mM Tris-硼酸，20 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 l.称量下列试剂，置于l L烧杯中。Tris108 gNa2EDTA2H2O
2、7.44 g硼酸55 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。10MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer 组份浓度 200 rnM MOPS，20 mM NaOAc，10 mM EDTA配制量 1 L配制方法 1.称41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。 2.加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。 3.使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4.再向溶液中加入下列试剂。1 M NaOAc(DEPC处理)20 ml0.5 M EDTA(pH8.0)(DEPC处理)20 ml 5.用DEPC处理水将溶液定容至1 L。
3、 6.用0.45 m滤膜过滤除去杂质。 7.室温避光保存。注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。溴乙锭 (10 mg/ml)组份浓度 10 mg/ml溴乙锭配制量 100 ml配制方法 1.称量1 g溴乙锭，加入到100 ml容器中。 2.加入去离子水100 ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。 3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 4.溴乙锭的工作浓度为0.5 g/ml。注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作。Agarose凝胶 配制方法 1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是0.5TBE或1TAE)。 2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当
4、的锥形瓶中。 3.加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)。 注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。 4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。小心摇动锥形瓶。使琼脂糖充分均匀熔化。此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化。必须注意，在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。熔化琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全熔化，否则，会造成电泳图像模糊不清。 5.使溶液冷却至60左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓度0.5
5、g/ml)。并充分混匀。 注：溴乙锭是一种致癌物质。使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好手套。 6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度 一般在35 min之间。 7.在室温下使胶凝固(大约30 min1 h)，然后放置于电泳槽中进行电泳。 注：凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4下保存，一 般可保存25天。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖浓度最佳线形DNA分辨范围(bp) 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0% 1,00030,000 80012,000 50010,000 4007,000 2003,000 502,0006 L
6、oading Buffer(DNA电泳用) 组份浓度30 mMEDTA36%(V/V)Glycerol0.05%(W/V)Xylene Cyanol FF0.05%(W/V)Bromophenol Blue 配制量 500 ml 配制方法 1.称量下列试剂，置于500 ml烧杯中。EDTA4.4gBromophenol Blue250 mgXylene Cyanol FF250 mg 2.向烧杯中加入约200 ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解。 3.加入180 ml的甘油(Glycerol)后，使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4.用去离子水定容至500 ml后，室温保存。10 Lo
7、adlng Buffer (RNA电泳用)组份浓度10 mMEDTA50%(V/V)Glycerol0.25%(W/V)Xylene Cyanol FF0.25%(W/V)Bromophenol Blue配制置 10 ml配制方法 1.称量下列试剂，置于10 ml离心管中。0.5 M EDTA(pH8.0)200 lBromophenol Blue25 mgXylene Cyanol FF25 mg 2.向离心管中加入约4 ml的DEPC处理水后，充分搅拌溶解。 3.加入5 ml的甘油(Glycerol)后，充分混匀。 4.用DEPC处理水定容至10 ml后，室温保存。四、核酸、蛋白质杂交用相
8、关试剂、缓冲液的配制方法20SSC 组份浓度 3.0 M NaCl，0.3 M Na3citrate2H2O(柠檬酸钠)配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl175.3 gNa3citrate2H2O88.2 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3滴加14 N HCl，调节pH值至7.0后，加去离子水将溶液定容至1 L。 4.高温高压灭菌后，室温保存。20SSPE Buffer 组份浓度 3.0 M NaCl，0.2 M NaH2PO4，0.02 M EDTA配制量 1.L配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl175.3
9、gNaH2PO4H2O27.6 gNa2EDTA2H2O7.4 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加NaOH调节pH值至7.4(约6.5 ml的10 N NaOH)。 4.加去离子水将溶液定容至l L。 5.高温高压灭菌后，室温保存。50 X DenhardtS溶液 1%(W/V)Ficoll 400(菲可400/水溶性聚蔗糖400)1%(W/V)Polyvinylpyrrolidone(聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮)1%(W/V)BSA组份浓度配制量 500 ml配制方法 1.称量下列试剂，置于500 ml烧杯中。Flcoll 4005 gPoLyvlnylpyrr
10、olldone5 gBSA5 g 2.加去离子水约400 ml，充分搅拌溶解 3.加去离子水将溶液定容至500 ml。 4.用0.45m滤膜过滤后，分装成每份25 ml。 5.-20保存。0.5 M磷酸盐Buffer 组份浓度 0.5 M Na2HPO4。 配制量 l L 配制方法 1.称量134 g Na2HPO47H2O置于l L烧杯中。 2.加入约800 ml的去离子水充分搅拌溶解。 3.加入85%的H3PO4(浓磷酸)调节溶液pH值至7.2。 4.加去离子水定容至1 L。 5.高温高压灭菌后，室温保存。Salmon DNA (鲑鱼精DNA) 组份浓度 10 mg/ml Salmon D
11、NA配制量 约100 ml配制方法 1.称取鲑鱼精DNA 2 g置于500 ml烧杯中，加入约200 ml的TE Buffer。 2用磁力搅拌器室温搅拌24 h，溶解后加入4 ml的5 M NaCl，使其终浓度为0.1 M。 3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。 4.回收水相溶液后，使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次，以 切断DNA。 5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。 6.离心回收DNA后，溶解于100 ml的去离子水中。测定溶液的OD260值。 7.计算溶液的DNA浓度后，稀释DNA溶液至10 mg/ml。 8.煮沸10min后，分装成小份(1 ml/份)。-20保存。 9.使
12、用前在沸水浴中加热5min后，迅速冰浴冷却。DNA变性缓冲液 组份浓度 1.5 M NaCl，0.5 M NaOH 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl87.7 gNaOH20 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。预杂交液/杂交液 (DNA杂交用)6SSC(或SSPE)5Denhardts0.5%(W/V)SDS100 g/mlSalmon DNA 组份浓度 配制置 100 ml 配制方法 1.称量下列试剂，置于200 ml烧杯中。20SSC(或SSPE)30 ml50Denhardts10 ml10% SDS 5 ml10 mg/ml Salmon DNA1 mldH2O54 ml2.充分混匀后，使用0.45 m滤膜滤去杂质后使用。预杂交液/杂交液(RNA杂交用)6SSC(或SSPE)5
