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1、层析分离方法概述层析法一一是一种使不同分子相互分离的过程，当一混合样品被导入一固定相的支持体 中，而另一流体 （移动相 ）通过时，由于样品各组分与固定相和移动相相互作用的大小不同， 使各组分通过固定相支持体的速率不同而得分离。层析法的特点： 能分离一系列结构较为相似的成分，以达到一般分离方法难以达到的 目的。 层析常见种类及用途 :a. 柱层析分离量较大，主要用于分离制备；b. 薄层层析一一主要用于分析鉴定，也可用于半微量制备。c. 纸层析一一主要用于分析鉴定，也可用于半微量制备。 层析法按分离原理大体上又可以分为（1）吸附层析 （利用吸附能力的差别进行分离 ），常用的吸附剂有氧化铝、 硅胶、
2、聚酰胺等；（2）分配层析 （利用在二种不互溶的溶剂中分配比不同进行分离 ），常用的支持剂为硅胶、 硅藻土、纤维粉等，反相硅胶 （键合硅胶 ）、液滴逆流层析则是分配层析与逆流分溶的发 展；（3）离子交换层析 （利用离子解离强度不同进行分离 ），常用的离子交换树脂有强酸性 （磺 酸型）、强碱性（季胺型）、弱酸性 （羧酸型）、弱碱性（三级胺型） ；（4）电泳 （利用电流通过时，离子趋电性不同进行分离 ），常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝 胶电泳。（5）其他有气体层析、凝胶层析、亲和层析等， 层析方法的选择：（1）非极性的成分常选择氧化铝或硅胶吸附层析；（2）极性较大则采用分配层析或弱吸附剂吸附层析；（3
3、）酸性、两性成分可用离子交换层析，有时也可用吸附层析及分配层析。 各类化合物适宜的层析方法：a. 一般生物碱的分离可用硅胶或氧化铝层析，对极性较高的生物碱也可用分配层析，而 对季胺型水溶性生物碱也可用分配层析或离子交换层析。b. 甙类的层析分离往往决定于甙元的性质，如皂甙、强心甙，一般可用分配层析或硅胶 吸附层析。c. 芳香油、甾体、萜类 （结合成甙除外 ）包括萜类内酯，往往首选氧化铝及硅胶层析，若在氧化铝柱上有次级反应，则宜用硅胶吸附层析d. 黄酮体、单宁等多元酚衍生物可用聚酰胺吸附层析。e. 有机酸、氨基酸一般可选用离子交换层析，有时也用分配层析，有些氨基酸也可用活性炭吸附层析。f. 多肽
4、、多糖等大分子化合物，常用凝胶层析、亲和层析、反相硅胶（键合硅胶）。第一部分柱层析第一章硅胶层析一、层析用硅胶层析用硅胶一般以SiO2 XH2O表示，系多孔性的硅氧环 Siloxane（a交链结构，由于其骨架11SiO-SiSLOH111（a）（b）表面具有很多硅醇Silanol（b）基团，能吸着多量水分，此种水分几乎成游离状态存在，因此当加热至100C左右能可逆地被除去。硅胶的活性水分含量有关（见表7-1），表7-1氧化铝和硅胶含水量与活性的比较硅胶加入水量（% ）活性氧化铝加入水量（% ）0I05II315III625IV1038IV15含水量高则吸附力减弱，当游离水含量高达 仃以上，吸附
5、能力降低，而可作为分配层 析载体。I IO O一 SLOSOH11O OII（c）硅胶于500E加热能不可逆地失去结合水（一般170C以上即有少量结合水失去），从硅醇 结构变成硅氧环结构，若加热至1,100C则结合水尽失。由于硅胶的吸附能力主要与硅羟基数 量有关，因此加热温度过高吸附能力反而降低。有时硅胶层析具有吸附层析与分配层析的双重性质，甚至还有极弱的离子交换作用。层析硅胶应是中性无色颗粒，但是由于制作过程常可带有酸性，如果酸性不强于pH5，一般已可使用。商品层析硅胶合格的判定a. PH值-一般先检查其是否中性。取硅胶一份混悬于100份水中放置，应得澄清的中性溶液。如滤液为酸性，应水洗至中
6、性，再行活化处理。b. 铁离子的检查-一般将硅胶混悬于盐酸中，搅拌，如含铁离子则与盐酸结合成复 合物而显黄色。有铁离子存在即预示有其他金属盐存在的可能性，因此最好以盐 酸洗涤处理。在特殊情况下，硅胶须经乙醚、氯仿等有机溶剂预洗，至洗出液蒸 干无残渣为止。由于硅胶容易吸水，因此用前最好经 120C烘24小时活化，可不作活性测定。硅胶的改良：向层析硅胶中加入一种复合试剂，以改良吸附性能，提高分离效果，称改良吸附剂。例如以硝酸银处理的硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用。以110%复合试剂的水或丙酮溶液，与硅胶混匀，待稍干后于110C干燥即可。表7-2常用改良吸附剂复合试剂选择性分离物0.10.5 N酸
7、或碱AgN03硼酸、硼酸钠、碱式醋酸铅亚硫酸钠氯化铁硫酸铜铁氰化锌pH敏感物质(生物碱、酸性、酚性、两性物质) 具有双键或二键物质多羟基化合物醛类羟基喹啉类胺类磺胺类二、硅胶吸附层析的应用硅胶层析的优、缺点：优点：(1)有些化合物用氧化铝层析,吸附剂副反应较多，而且某些副反应即使用中性氧化铝仍难以避免。而硅胶作吸附剂虽也有个别发生异构化，但一般副反应较少；(2) 某些酸性、酚性物质、色素等易与氧化铝结合而不宜使用氧化铝层析，硅胶则无此 特性；(3) 氧化铝层析样品损失较多，而硅胶层析样品回收率较高 缺点：(1) 即分离效果有时较氧化铝为差，对杂质的吸附能力差；(2) 样品处理量相应的比氧化铝为
8、低硅胶吸附层析的操作快速层析(Flash Chromatography)既快速简便，又有相当分离效果注；玻璃磨口连接处用弹簧或橡皮圈扣紧。橡皮管连接处一般在压力为1kg/cm2以下不会脱开。操作步骤1 .装柱A. 干法向层析柱中加入 0.51cmn高的硅胶H( 100200 mesh/目)，再将硅胶H (300400 mesh 左右，即38 m(10-40 m)装入柱，敲紧或在出口处抽真空吸紧，使硅胶层高约18 20cm,硅胶层面应水平，上部再加0.51cm高的纯净砂层或滤纸。然后加入洗脱用的溶 剂，加压赶去硅胶内气泡，溶剂压至硅胶层顶面，此时硅胶层高约1517cm=B. 湿法bi.即将硅胶混
9、悬于装柱溶剂中，不断搅拌待空气泡除去后，连同溶剂一起倾入层析柱中。最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段， 容易影响分离效果。b2向硅胶中加入一定体积的溶剂，充分搅匀，加入到预先装有一定体积溶剂的层析柱内(已加粗硅胶H)，同时打开活塞放出溶剂，硅胶下降。加压赶去硅胶内气泡，至层高约1820cm溶剂压至硅胶层顶面，此时硅胶层高约1517cm2.硅胶柱内包含溶剂体积的确定(干法)取一定体积Vo的溶剂，加压至砂板处，将层析柱的活塞稍打开，使溶剂滴入接受器中，当氧化铝柱上面的溶剂液面刚好降至填 料表面，关闭活塞，量取接受器内溶剂量Vi。贝U Vo Vi即氧化铝柱内包
10、含溶剂的体积 V。依据 V，在层析过程中，可知在什么时候开始收集流份。当变换溶剂的时候，就可知道新换溶剂大致在何流份开始3. 加样用尽量少的溶剂溶解样品，然后加至柱中，加压压入硅胶层。难溶样品拌入少量硅胶再 装入，上面再复以砂层。4. 洗脱根据薄层层析资料的判断，用在硅胶薄层板上欲分点为Rf=0.20.3的展开溶剂洗脱，如有多点需分离时，可以改变洗脱溶剂的比例。用减压阀控制压力以调节洗脱速度，收集馏 分。而且为了尽量减少被分离化合物在层析柱中扩散，层析过程中不能有间歇。5. 样品收集每一馏分用薄层板点样分析，每块薄层板上可点数个馏分点，用原料做对照，前一块板 的最后一点应用于下一块板的第一点做
11、对照点。将相同位置点的馏分合并，蒸除溶剂。柱的粗细和进样量等的关系（表1）这时施加的压力约 0.40.7kg/cm2（可用压力表指示）。为了达到最好分离效果，使用 者可根据具体样品摸索条件。例:Jo O表1柱内径（mrj）1417253552硅胶用量（g）10163570150加样量（g）0.20.51248流速（ml/min ）510152030每一馏分体积（ml）2.5481525H酸CH3CN室温1.2g原料反应5d后，用硅胶薄层层析显示（展开剂：石油醚 /乙酸乙酯82），主要为二个斑点：Rf分别为0.23和0.14,相应于未反应原料和产物。Rf=0.23,原料Rf=0.14,产物点照对
12、料原卜卜 * * w $ m卜0123456789 10 11 12 a卜卜-lr 冬 Ml-卜12 13 14 15 16 仃 18 19 20 21 22 23 24(4)用快速层析法分离（柱内径25mm,青岛海洋化工厂硅胶H 35g,硅胶层加压后高17cm） 先用120ml石油醚/乙酸乙酯（82）洗脱，再用400ml石油醚/乙酸乙酯（8 2）洗脱。加压力0.7 kg/cm2，流速0.5ml/min。开始80ml未收集，以后收集15ml左右为一馏分。馏分 17: 0.01g,低极性物；馏分815: 0.49g,相应于Rf 0.23的原料；馏分1618:交叉馏 分；馏分 佃34:0.37g相
13、应于Rf 0.14的产物。收集时间约1.5h。总之，此层析法可用于 Rf差0.05到0.1的组分分离，一般在2h左右可分离一个样品， 既达到一般柱层析的分离效果，又节省了时间，而且溶剂和硅胶用量也可减少。对不太稳定 的化合物，用此法分离尤为适用。吸附柱层析硅胶的用量样品与吸附剂的比例可为13060,但必须根据分离工作的难度，较难分离者有时甚至可选用 15001000。硅胶吸附层析适用范围一一使用比较广泛，能用于非极性化合物，也能用于极性化合物， 适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪 酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。三、硅胶的再生1.
14、 由于硅胶对杂质及色素吸附力差，因此回收操作比氧化铝简单，一般可用乙醇或甲醇洗涤， 或于索氏提取器连续抽提除去杂质， 洗净的硅胶待溶剂挥发除去后，烘干活化处理即可使用。2. 硅胶的再生也可用510倍体积的1 %氢氧化钠煮沸半小时，如仍不成强碱性（以酚酞作指 示剂），可追加适量1 %氢氧化钠，趁热过滤，以蒸馏水洗三次，冉以 36倍5%盐酸煮沸半小时，以蒸馏水洗至中性，120C活化，过筛即得。四、分配层析的原理及操作一种溶质在两种不相互溶的溶剂中振摇，当达到平衡时，溶质在两层中浓度都有恒定的比例，这一比值称作该物质在这两种溶剂中的分配系数。如果需要分离的两种物质，在两相中的分配系数比较接近，则须利用不断地进行反复分配，如使用逆流分溶及分配层析才能达到目的。1. 分配层析的原理分配层析是以一种多孔物质吸着一种极性溶剂，此极性溶剂在层析过程中始终固定在支持剂上，因此称为固定相。另用一非极性溶剂（与固定相不相互溶）洗脱，此洗脱剂在层析过程中始终是移动的，称为移动相。溶质在固定相和移动相之间，在 柱上作连续的、动态的不断分配，由于不同成分在两相间分配系数的差异而得以分开。2. 影响分离效果片的因素 一一两者的分配系数差值。如果相差较大，只要用较小的柱和 较少的硅胶用量即能满意地分离，如果分配系数差值极小，则同样重量的样品往往要用较大 的柱和用较多的硅胶才能分开。3.
