革兰氏染色与显微观察

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1、实验一：细菌的革兰氏染色与显微镜观察（一）实验目的1. 了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理2. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。3. 在油镜下观察细菌几种基本形态4掌握细菌革兰氏染色法（二）实验原理1显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显 微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置最主要包括调焦系统、载物台和 物镜转换器等运动部件，以及底座、镜臂和镜筒等支撑部件。光学系统包括不同倍数的物镜、 目镜以及由聚光镜和反光镜组成的照明装置。显微镜的成像原理（放大原理）：光线反光镜遮光镜通光孔标本工一定要透明）物镜的透 镜

2、（第一次放大成倒立实像）镜筒目镜（在放大成虚像）眼显微镜的放大倍数=目镜放大倍数*物镜放大倍数在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光 学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他 物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的 原因：（ 1） . 增加照明亮度油镜的放大倍数可达100 X,放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要 的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气， 再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用

3、油镜时会因射入的 光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻 片之间加入与玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的油镜（通常用香柏油，其折射率 n=1.5 2）。（2.）增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 （resolution or resolving power） 是指显微镜能辨别两 点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物 镜性能的限制，分辨力D可表示为：D=2N.A,式中入=光波波长；NA=物镜的数值 孔径值。光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4-0.7 m m ），而数值孔径值则 取决于物

4、镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=n x sin a式中a为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最 大只能达到 120 O ，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空气及水 的折射率（分别为 1.0 和 1.33 ）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所 能达到的数值孔径值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于 1.0）。若以可见光的平均波长0.55 pm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只 能分辨出距离不小于0.4pm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2 p m左右。2.

5、革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是 细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法所以能将细菌分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰 氏染色的不同反应，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫 初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结 晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂

6、处理时，两 类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成， 壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小， 透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留 初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当 脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容 易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。（二） 实验器材1. 菌种枯草芽抱杆菌1218h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面 培养物、大肠杆

7、菌 24h 营养琼脂斜面培养物2. 溶液或试剂香柏油，结晶紫染色液、卢戈碘液、 95%乙醇、番红染色液，蒸馏水3. 仪器及相关用品 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、镊子（三）实验方法1. 显微观察 显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序。 油镜观察摆好显微镜，接通电源，调节好照明亮度，低倍镜下找到要观察的样品区域后，用 粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面 注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至 最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0 ，还应在聚光镜与载玻片之间 也加滴香柏

8、油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐 上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。2. 革兰氏染色（ 2）初染滴加结晶紫（以覆盖细菌涂面为准）于玻片的涂面上，染色 12min ，倾去染色液，水洗： 倾去滤液，用自来水冲洗，直到涂片上留下的水无色为止。（水洗时，不要直接冲洗液面， 而应使水从载玻片的一端流下水流不宜过急过大，以免涂片薄膜脱落。） 干燥：自然干燥或电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。（ 3 ） 媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约 1 min ，水洗。（ 4） 脱色将在玻片上的水甩净，并衬以白背景，用 95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色为止， 一

9、般要用时2030s,立即用水冲净酒精。注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性 菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约2030s。（5）复染用番红染液12mi n,水洗。（6）镜检 干燥后，用油镜观察。革兰氏阳性细菌呈蓝紫色；革兰氏阴性细菌呈红色。以分散开的细菌 的革兰氏染色反映为准，过于密集的细菌，常呈现假阳性。4用毕后的处理（1 ）上升镜筒，取下载玻片。（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦 去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。（3）分还原，反光镜垂直于镜座，将物

10、镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下， 以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。（四）实验结果1 绘出你在油镜下观察到的三种菌的形态2.列表简述两株细菌的染色结果（菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。菌种形状颜色革兰氏染色枯草芽抱杆菌细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可 排成链状的，有的菌体里有椭圆芽抱 （无色）或在视野中有散在的芽抱。紫色阳性金黄色匍萄球菌大部分排列成葡萄串状，无芽胞、鞭毛， 有的单个存在，为一个小的球体紫色阳性大肠杆菌细菌形态为短小的杆状，单个存在红色阴性（五）思考题1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？ 答：（1）应该先用低倍镜找到样品区域，

11、再转换高倍镜，在转换时要注意不要转错方向； 油镜只可以在100倍或者标有oil的物镜才可以使用;在转换过程中不要调节粗准焦螺旋； 在观察中亮度要调到最亮，否则视野会不够亮。（2）滴加的油是香柏油（3）作用主要有两个方面：一、增加照明亮度。二、增加显微镜的分辨率。2、影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜性能（直径和焦距等），目镜，透光率，光线亮度等。3、为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 答：在使用高倍镜时，物镜离载物台很近，而粗调节器上升下降的速度很快，调节有误就会 撞坏物镜。4、为什么要求涂片完全干燥后才能用油镜观察？制备细菌染色标本时，应该注意哪些环 节？答：（

12、1）因为用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上的液体会污染油 镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察.正常情况下,观察前要用擦镜纸擦拭干净. （2）接种前要灼烧玻璃片，除去上面的脂质，否则菌种在水中很难散接种时要注意菌种不 要太多，否则会出现细菌堆积，观察不清并且会出现假阳性；不要太少，否则水洗操作会把 样本冲掉，在观察是很难找到观察对像；固定时要注意温度，很容易就会把细菌灭活了。5、涂片在进行染色前为什么要先进行固定？固定时应该注意什么问题？ 答：在染色或者水洗的时候都会把菌种冲走。固定时要注意载玻片温度，很容易就会把细菌 灭活了。6、进行革兰氏染色时，为什么特别强调

13、菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应,关键在于细胞壁的通 透性的改变，使结晶紫染液可以脱色透出，着色不均染色效果不好7、哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？答：脱色环节，脱色不足会把革兰氏阳性菌染成阴性菌，脱色过度会把阴性菌染成阳性菌。 染色环节，染色时间不足，着色不好，或者没有着色。涂片环节，菌种的培养时间不好，涂 片的菌种过多，固定时灭活了。其中最关键是脱色环节。&假设微生物实验室中有一种待测细菌，设计一个方案测出该细菌是G+还是G-答：纯种培养，然后革兰氏染色（涂片，初染，媒染，脱色，复染）油镜下观察（红色G- 紫色G+）。重复试验多次，检验实验结果的正确性。得出结论（六）实验总结1、在本次试验中一定要有耐心，观察细菌的时候调节很麻烦，必须认真按照实验步骤，慢 慢找到细菌。2、在制作涂片时候要注意，除去脂质，水不要太多，制作出来的图片会更好。脱色时候要 特别小心，第一次大肠杆菌时候就是没有注意，制作的涂片失败了。3、实验是一个学习的过程，我们必须认真观察，学习到知识，即使试验失败了，也要认真 总结，找出失败的原因，下次改进。