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1、 怀化医专微生物学检验教案 编号：2010年上学期授课教师桂 芳教研室主任审核签名李争鸣教学课题螺旋体及检验课时授课时间月 日 月 日 月 日 月 日 月 日 月 日2星期星期星期星期星期星期授课对象检验专业班级目的要求【掌握】钩端螺旋体，梅毒螺旋体的生物学特性和微生物学检验。【熟悉】1、回归热螺旋体和伯氏疏螺旋体的特性。2、各类螺旋体的致病与免疫性。【了解】 防治原则和其他螺施体。教学重点及难点重点：1、螺旋体的概念与特征2、钩端螺旋体的主要生物学性状及微生物学检验3、梅毒螺旋体的主要生物学性状及微生物学检验难点： 钩端螺旋体、梅毒螺旋体的微生物学检验。教法与学法讲授法课型理论课教学手段多媒
2、体教学内容与时间分配1、概述：主要特点及分类。（10min）2、钩端螺旋体：形态染色、培养、抗原构造与分类。致病性与免疫性，微生物学检查及防治原则。（35min）3、梅毒螺旋体：形态染色、培养特性、抗原构造。致病性与免疫性，微生物学检查及防治原则。（35min）4、其他螺旋体。(10min)小 结 （10min）复习思考题1、什么叫螺旋体？有哪些特征？2、梅毒螺旋体的血清学检测包括哪些试验？其原理如何？参考资料1、张卓然主编 临床微生物学与微生物检验人卫出版社 第3版 2006.112、倪语星主编 临床微生物学与检验 人卫出版社 第4版， 2007年3、李凡主编 医学微生物学 人卫出版社 第7
3、版 2008.1自评本次课首先应重点讲授螺旋体的概念与基本特征，尤其是与其他微生物的区别。其次是钩端螺旋体、梅毒螺旋体的微生物学检查及致病性，螺旋体常用的染色法是镀银染色法，该法的操作方法及结果观察可以放在实验课介绍。第二十七章 螺旋体及检验(spirochete)螺旋体是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状、运动活泼的原核细胞型微生物。生物学地位介于细菌与原虫之间。有细胞壁、原始核，以二分裂方式繁殖，对抗生素敏感等。其中致病性螺旋体主要有钩端螺旋体属、疏螺旋体属、密螺旋体属等3个属。第一节 钩端螺旋体（Leptospira）有2种：问号钩端螺旋体人畜共患病；双曲钩端螺旋体不致病。一、生物学性状1.
4、形态染色 螺旋细密、规则，形似细小珍珠排列的细链。一端或两端呈钩状，故名钩端螺旋体。运动活泼，常使菌体呈C、S或8字型。G-，但不易着色。常用Fontana镀银染色法，被染成棕褐色。暗视野显微镜下可见活泼运动、折光性强而成白色的钩端螺旋体。2.培养特性需氧或微需氧，营养要求高，常用Korthof培养基，其中含10%新鲜灭活兔血清或牛血清，蛋白胨和磷酸盐缓冲液（血清除促进钩体生长外，还可中和其产生的毒性）。 适宜生长温度为28-30，若11-13能生长的为非致病的双曲钩端螺旋体。最适pH7.2-7.6，pH 6.5死亡，最高能耐pH8.4。在人工培养基中生长缓慢：液体培养基：28培养1-2周，液
5、体培养基呈半透明云雾状生长。1%琼脂固体：281-3周，可形成透明、不规则，d 2mm的扁平小菌落 。生化反应不活泼，不分解糖类和蛋白质，有过氧化氢酶，有的菌株可溶血。3.抵抗力 对热和酸抵抗力弱，601min即死亡。0.2%来苏、1:2000升汞、1%石炭酸经1030 min被杀灭。对青霉素敏感。在夏秋季酸硷度中性的湿土或水中可存活20天以上，甚至数月之久，这在本菌的传播上有重要意义。4. 抗原构造与分类 1）属特异性抗原（菌体抗原）：脂多糖复合物，用于分群。2）型特异性抗原（表面抗原）：多糖蛋白复合物，用于分型。问号状钩端螺旋体至少可分为25个血清群、273个血清型。 我国已发现的致病性钩
6、端螺旋体至少有19个血清群、74个血清型，是发现血清型最多的国家。二、致病性与免疫性1、致病物质（1） 内毒素样物质(ELS)或称脂多糖样物质(LLS)（2） 溶血素：溶解红细胞，引起贫血、出血、肝肿大、黄疸、血尿。（3） 细胞毒性因子(CTF)：引起小鼠肌肉痉挛、呼吸困难而死亡。（4）细胞致病作用(CPE)物质：56经30分钟被破坏。注射入家兔，可形成红斑和水肿。 2、所致疾病 钩端螺旋体病（一种人畜共患传染病）。储存宿主：鼠和猪，其他：50多种动物（蛇、鸡、鸭、鹅等）传播途径：人与污染水或土壤接触,经粘膜或破损皮肤进入;经胎盘垂直传播.临床表现：大多隐性感染，随尿排出。轻重程度与感染钩体型
7、别、毒力、免疫性有关。轻者似感冒，重者引起内脏器官和神经系统的损害。先形成钩体血症,进入损伤全身毛细血管内皮细胞及肝、肾、肺心及中枢神经。疾病特点：起病急、高热、乏力、全身酸痛、眼结膜充血、腓肠肌压痛、表浅淋巴结肿大。免疫性：疾病后可获得抗同型钩体的持久免疫力。细胞免疫为主。三、微生物学检查法（一）标本采集 钩端螺旋体可从临床标本、携带者和自然界的水中分离获得。标本包括血液、尿和脑脊液，发病早期(10天内)血液的阳性率高，2周后尿和脑脊液等的阳性率高。感染610天取血可检出抗体，在病程第3或4周达最高水平，此后抗体水平逐渐下降，血清学诊断则需在病程早期及恢复期分别采集血清，作双份血清试验。 （
8、二）检验方法 1、标本直接检查（1）镜检：取急性期病人血先以1000rpm离心510min，再取血浆以4000rpm离心4560min，取1滴沉淀物置玻片上，加盖玻片后作暗视野检查。也可用Fontana镀银染色法染色后观察。（2）核酸检测：采用同位素或生物素、地高辛标记的特异DNA探针法，检出标本中钩端螺旋体的核酸，较培养法快速、敏感。若先用PCR技术先行扩增，再用探针确定，则敏感度更加提高。2、分离培养 取钩端螺旋体血症期的病人血液2ml 或发病后第2周的无菌弱碱性尿沉渣接种于Korthof 培养基中，28孵育，因系需氧生长，故靠近培养液面呈半透明雾状混浊。取培养物作暗视野检查，观察有无螺旋
9、体生长，一般714天生长。连续观察30d，如无生长方判为阴性。3、血清学检测（1）显微镜凝集试验（MAT） 是常用的方法。1)抗原制备：取标准菌株47天的培养物，每视野5060条活钩端螺旋体。2)方法与结果：取病人血清以56，30min灭活后稀释，每个稀释度0.1ml 血清中加入等量活菌抗原，302h后，取1滴覆盖玻片，暗视野显微镜下若有抗体存在，则钩体凝集成团，数减少，当抗体效价高时，凝集的菌体溶解。 结果判定：50以上菌体凝集或溶解为“2+” 为血清效价。1：300才有诊断意义，或效价增高4倍以上，则可确诊本病。 （2）酶联免疫吸附试验 用ELISA法和IgM斑点-ELISA法等间接检测钩
10、体病人血清中特异性抗体，用于该病的快速诊断。 包被抗原用钩端螺旋体培养物经超声波破碎，15000rmin离心20min，用于包被的抗原浓度以20gml为好。被检血清OD值为阴性对照的2倍，即为阳性。4、动物试验 动物是分离钩端螺旋体的敏感方法，尤其适用于有杂菌污染的标本。 方法是将标本接种于幼龄豚鼠或金地鼠腹腔。接种35d后，可用暗视野显微镜检查腹腔液；亦可在接种后36d取心血检查并作分离培养。动物死后解剖，可见皮下、肺部等有大小不等的出血斑，肝、脾脏器中有大量钩端螺旋体存在。第二节 梅毒螺旋体（Treponema pallidum, TP）（苍白密螺旋体苍白亚种），STD中危害最大的一种。一
11、、生物学性状1.形态与染色 8-14个致密而规则的小螺旋，两端尖直，运动活泼。革兰染色阴性，不易着染Fontana镀银染色法染成棕褐色。 电镜下观察，有细胞壁和细胞膜。细胞壁外有包膜，细胞膜内为含细胞质和核质的螺旋形原生质圆柱体。绕着34根周浆鞭毛或内鞭毛 ，与运动有关。作移行、曲伸、滚动式运动。2、培养特性 不能在无活细胞的人工培养基中生长繁殖。 Nichols株能在家兔睾丸和眼前房内繁殖并保持毒力，在细胞中能有限生长，繁殖慢，约30h才分裂一次 。含3%-4%氧时生长最宜 。 Nichols株：有毒力 Reiter株：毒力弱3.抵抗力 极弱。对温度和干燥特别敏感。41.5经1h死亡，在50
12、时5min死亡；在血液中，4置3d后可死亡。离体后1-2h将死亡。对常用化学消毒剂亦敏感，1%2%石炭酸内数分钟就死亡。对青霉素、四环素、红霉素或砷剂均敏感。二、致病性与免疫性1、致病物质 外膜蛋白-与宿主细胞粘附。 透明质酸酶-利于扩散。宿主细胞纤维粘连蛋白覆于表面-免受宿主免疫细胞攻击。2、所致疾病-梅毒 人是梅毒的唯一传染源，有先天性和获得性两种 。 获得性性接触传播先天性母体胎盘胎儿 获得性梅毒期（初期）梅毒：感染性极强，破坏性小。感染后3周左右局部出现无痛性硬下疳，多见于外生殖器，一般48周后，常自愈。渗出液中有大量苍白亚种螺旋体。期梅毒：感染性强，破坏性小。发生于硬下疳出现后28周
13、。苍白亚种螺旋体血症，全身皮肤、粘膜常有梅毒疹（扁平湿疣），全身淋巴结肿大，有时亦累及骨、关节、眼及其他脏器。在梅毒疹和淋巴结中，存在有大量苍白亚种螺旋体。期(晚期)梅毒：感染性小，破坏性大。发生于感染2年以后，亦可长达1015年。病变可波及全身组织和器官。基本损害为慢性肉芽肿，局部因动脉内膜炎所引起的缺血而使组织坏死。皮肤、肝、脾和骨骼常被累及。若侵害中枢神经系统和心血管，可危及生命。先天性梅毒（胎传梅毒）多发生于妊娠4个月之后。 苍白亚种螺旋体经胎盘进入胎儿血流，并扩散至肝、脾、肾上腺等大量繁殖，引起胎儿的全身性感染，导致流产、早产或死胎；出生梅毒儿，呈现马鞍鼻、锯齿形牙、间质性角膜炎、先
14、天性耳聋等特殊体征。免疫性：抗体梅毒特异性抗体（IgG和IgM），有制动作用，对机体再感染有保护作用；抗脂质抗体反应素（IgM和IgG混合物），对机体无保护作用，用于血清学诊断。三、微生物学检查法标本 ：期梅毒-硬下疳渗出液；期梅毒-梅毒疹渗出液或局部淋巴结抽出液1.直接显微镜检查 将上述检材置于玻片上用暗视野显微镜检查，如见有呈现运动活泼，沿其长轴滚动、屈伸、旋转、前后移行等的螺旋体即有诊断意义。也可做镀银染色、荧光抗体染色或Giemsa染色。2.核酸检测用PCR技术直接检测临床标本中梅毒螺旋体的特异性DNA片段，用于检测的引物和探针是编码外膜蛋白47kD的基因，其扩增产物经斑点印迹，或电泳Southern 印迹法鉴定。3.抗体检测(1)非密螺旋体抗原试验多用牛心肌的心脂质作为抗原，测定病人血清中的反应素。将抗原包被到载体颗粒上，如：胆固醇（VDRL、USR）、活性炭（RPR）、甲苯胺红（TRUST）。均为初筛试验。初期梅毒病灶出现后1-2周时，阳性率为5383，二期梅毒的阳性率
