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1、河南宏翔生物科技有限公司 河南省多功能生物蛋白工程技术研究中心通 用 工 艺编号：HXSW/QC05-2012修订：第 1 版 第 0 次修改发酵饲料中可溶性还原糖和总糖的测定起草：刘永垒 日期：2012.09.24批准： 日期：1 目的建立统一的原料、成品、发酵过程中还原糖和总糖的定性检测方法，确保检验方法的一致性、科学性和准确性2 范围适用于本公司发酵饲料中还原糖和总糖的检验3 责任者品控人员（进货检验员、制程检验员和最终检验员）负责检验4 正文4.1 原理还原糖是指含有自由醛基或酮基、具有还原性的糖类。黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色
2、的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。不具还原性的部分双糖或多糖经酸水解后可彻底分解为具有还原性的单糖。通过对样品中的总糖进行酸水解，测定水解后还原糖含量，可计算出样品的含量含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以系数0.9。4.2 仪器和试剂4.2.1 仪器分光光度计、电热恒温水浴锅 、试管及试管架 、容量瓶 、移液器 、量筒。4.2.2 试剂4.2.2.1 1mg/ml葡萄糖标准液准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖
3、100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，混匀，4冰箱中保存备用。4.2.2.2 DNS 试剂（3,5-二硝基水杨酸）将6.3g DNS和262ml 2mol/LNaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，7-10d后使用。4.3 操作步骤4.3.1 葡萄糖标准曲线制作取9支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作试剂012345678
4、葡萄糖标准溶液（mL）00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水（mL）21.81.61.41.21.00.80.60.4DNS（mL）1.51.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖含量（mg）00.20.40.60.81.01.21.41.6OD540将以上溶液，封口置沸水浴煮5min，冷浴冷却，定容至25mL，以0号管为对照，在540nm下测定吸光值，以葡萄糖质量为Y轴，吸光值为X轴，拟合曲线。标准曲线为：4.3.2 样品中还原糖和总糖的测定4.3.2.1 样品中还原糖的提取准确称取1.00g样品，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后补足至50ml
5、蒸馏水，搅匀，煮沸5min，使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到50mL离心管中，于4000r/min离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，即为稀释100倍的还原糖待测液（实验时可根据需要稀释至适当倍数：10、20、30、40、50、100、200等）。4.3.2.2 样品中总糖的水解和提取准确称取1.00g样品，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6mol/L 的HCl，置沸水浴中加热水解30min(1滴酚酞试剂检测呈微红)。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/L的NaO
6、H中和至微红色(至中性)，用蒸馏水定容在100ml容量瓶中，混匀，即为稀释100倍总糖待测液（实验时可根据需要稀释至适当倍数10、20、30、40、50、100、200等）。表2 样品还原糖测定试剂0123样品溶液(mL)01.01.01.0蒸馏水(mL2.01.01.01.0DNS（mL）1.501.501.501.50OD540通过标准曲线计算得到的还原糖量（mg）样品中还原糖或总糖质量分数（%）4.3.2.3 还原糖和总糖的测定取4支具塞试管，编号0、1、2、3。以制作标准曲线相同的方法，在1-3号试管分别加入1mL待测液和1mL蒸馏水，1.5mLDNS（保证与葡萄糖标准曲线制作相同的反
7、应体系），而对照的0号管内做则加2mL的蒸馏水和1.5mLDNS。封口置沸水浴煮5min，冷浴冷却，定容至25mL。在540nm下测吸光值。4.4 结果与计算计算光密度的平均值，根据所得标准曲线即可得到的还原糖的质量C，按下式计算样品还原糖和总糖的含量。计算公式由公式：整理得到。式中，1为还原糖（以葡萄糖计）的质量分数，%；2为总糖的质量分数，%； C为还原糖或总糖提取液浓度，mg/mL，本公式中C即为根据标准曲线计算得到的还原糖毫克数（测定时取用体积为1mL）；V为提取液的总体积，mL；（提取液的总体积即为稀释倍数）m为样品质量，mg。4.5 实验注意事项 样品的稀释倍数要保证计算得到的葡萄
8、糖浓度在标准曲线线性关系良好范围内。以往经验和文献报道表明，OD540在0.1-0.4范围内数据较为真实。发酵饲料中可溶性还原糖测定实验记录1 葡萄糖标准曲线制作取9支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作试剂012345678葡萄糖标准溶液（mL）00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水（mL）21.81.61.41.21.00.80.60.4DNS（mL）1.51.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖含量（mg）00.20.40.60.81.01.21.41.6OD540将以上溶液，封口置沸水浴煮5min，冷浴冷却，定容至25mL，以0号管为对照，在540nm下测定吸光值，以葡萄糖质量为Y轴，吸光值为X轴，拟合曲线。标准曲线为：2 样品中含糖量的测定试剂0123样品溶液(mL)01.01.01.0蒸馏水(mL2.01.01.01.0DNS（mL）1.501.501.501.50OD540通过标准曲线计算得到的还原糖量（mg）样品中还原糖或总糖质量分数（%）表2 样品还原糖测定1
