白介2研究进展(2).doc

《白介2研究进展(2).doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《白介2研究进展(2).doc（36页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、。白细胞介素 2 的研究进展 白细胞介素 -2 （ interleukin-2 ， IL-2 ） 是 T 淋巴细胞所产生的一类重要的淋巴因子， 具有广泛的生物学活性，不仅可以促进 T 、 B 淋巴细胞 、 NK 细胞 、 单核细胞的分裂增殖， 还可以促进其它细胞因子如干扰素等的分泌， 增强抗原提呈作用， 是调节机体免疫的重要细胞因子，在抗肿瘤 、 抗毒素及感染性疾病的治疗中也具有重要用自白细胞介素 -2 发现以来， 许多学者对其展开研究， 对白细胞介素 -2 的结构 、 分泌 、 调节 、 种属特异性 、 生物学活性 、 受体等方面有了较深的认识， 本文就白细胞介素 2 的研究进展作一综述IL

2、-2 的发现及命名l 当时分别称之为 “ 淋巴细胞丝裂原因子 ” （ lymphocyte mitogenic factor ） 、“ 致母细胞性因子 ” （ blastogenic factor ） 、“ T 细胞激活因子 ” （ T cell activating factor ） 。 1976 年， Morgan 等发现，将 T 细胞上世纪 60 年代，一些学者发现多种来源于植物的外源凝集素（ lectin ） 可在体外刺激淋巴细胞转化及增殖 。 这些外源凝集素如植物血凝素（ Phytohemagglutinin ， PHA ），刀豆蛋白 A （ Concanavalin A ， Con

3、 A ） 对淋巴细胞起着有丝分裂原的作用 。 在丝裂原刺激的淋巴细胞培养上清中具有可溶性丝裂原因子1u 丝裂原（ PHA ） 刺激的人外周血淋巴细胞培养上清加入体外培养的人白血病细胞或骨髓细胞之后， 该上清可导致上述细胞的体外增殖， 作者当时将种上清称为 “ 条件培养基 ” （ condition medium ， CM ） 。 表型分析及功能测定均证实， CM 诱导生长的细胞为正常 T 细胞群体 。 Gills 和 Smith3等利用 ConA 刺激的大鼠及小鼠 CM 先后在体外建立了小鼠细胞毒性 T 细胞（ Cytotoxic T Lymphocyte ， CTL ） 和辅助性 T 细胞（

4、 help T cell ， Th ） 克隆 。 这些传代培养的 T 细胞克隆株的生长严格依赖于 CM ， 去除 CM 后传代的 T 细胞迅速死亡 。 很显然， 能够促进效应性 T 细胞体外增殖的关键因素是存在于 CM 中的某些活性分子， 当时根据生物活性将其命名为 T 细胞生长因子（ T cell growth factor ， TCGF ） 。 1979 年第二届国际淋巴因子会议将 TCGF 命名为白细胞介素 -2 （ IL-2 ） 。 IL-2 的发现， 为体外长期培养 T 细胞克隆提供了方便， 也揭开了细胞因子网络研究的序幕 。 5 2. IL-2 的理化特性和生物学活性 通过 DEA

5、E-Sephacel 离子交换层析， Sephadex G-100 分子筛过滤， 制备性等电聚焦（ IEF ） 和聚丙烯酰胺凝胶电泳等生化提取手段， 已分离纯化了多种种属 IL-2 。 1979 犬白细胞介素 -2 基因的克隆 、 表达及表达产物的复性研究 年， Wastson 4 等首次纯化了小鼠的 IL-2 ，凝胶分析后认为，小鼠 IL-2 的分子量为 30 KD ，等电聚焦后形成两条带，等电点（ pI ） 分别为 4.3 和 4.9 。 此后，大鼠 、 人 、 长臂猿 、 豚鼠 、 兔 、 猪 、 绵羊 、 牛以及鸡等的 IL-2 相继被证实， 他们的一些特点见表 1 ，表 2 5,6

6、。 IL-2 的主要靶细胞是 T 淋巴细胞， 同时也具有下列生物学活性：（ 1 ） 促进 T 细胞生长及克隆性扩增；（ 2 ） 诱导或增强细胞毒性细胞（如 NK 、 LAK 、 TIL ） 的杀伤活性；（ 3 ） 协同刺激 B 细胞增殖及分泌；（ 4 ） 增强活化的 T 细胞产生 IFN 和 CSF ；（ 5 ）诱导淋巴细胞表达 IL-2R 。 年， Wastson 4 等首次纯化了小鼠的 IL-2 ，凝胶分析后认为，小鼠 IL-2 的分子量为 30 KD ，等电聚焦后形成两条带，等电点（ pI ） 分别为 4.3 和 4.9 。 此后，大鼠 、 人 、 长臂猿 、 豚鼠 、 兔 、 猪 、

7、绵羊 、 牛以及鸡等的 IL-2 相继被证实， 他们的一些特点见表 1 ，表 2 5,6 。 IL-2 的主要靶细胞是 T 淋巴细胞， 同时也具有下列生物学活性：（ 1 ） 促进 T 细胞生长及克隆性扩增；（ 2 ） 诱导或增强细胞毒性细胞（如 NK 、 LAK 、 TIL ） 的杀伤活性；（ 3 ） 协同刺激 B 细胞增殖及分泌；（ 4 ） 增强活化的 T 细胞产生 IFN 和 CSF ；（ 5 ）诱导淋巴细胞表达 IL-2R 。 表 1 天然 IL-2 的理化特性 3. IL-2 的结构与功能 蛋白质的结构（包括一级结构和空间结构） 与功能密切相关 。 近年来， 借助基因工程 、 蛋白质工

8、程技术， 已可在基因水平对 IL-2 进行定向改造， 并制造出多种变异的 IL-2 分子，为分析 IL-2 的结构功能关系铺平了道路 。 同时利用 X 线衍射对 IL-2 进行蛋白质晶体分析， 并结合电子计算机技术设计出了 IL-2 三维结构模型， 也为进一步阐明 IL-2 空间结构及 IL-2 与 IL-2 受体相互作用的机制奠定了基础 。 人 IL-2 由 133 个氨基酸组成， 其分子中有 3 个半胱氨酸（ Cys ）， 分别位于第 58 、 105 和 125 位， 第 58 与 105 位 Cys 之间形成一个二硫键 7 。 IL-2 的二级结构主要由 6 个 - 螺旋区组成，分别为

9、螺旋 A （ 11 19 ） 、 螺旋 B （ 33 56 ）（中间被 47 Pro 隔断，分为 B ， B ），螺旋区 C （ 66 78 ），螺旋区 D （ 83 101 ），螺旋区 E （ 107 113 ） 和螺旋区 F （ 117 133 ） 。 成熟的 IL-2 分子， 6 个螺旋区折叠， N 端与中区靠近， 螺旋区 B 、 C 、 D 、 F 形成一个反向平行的 - 螺旋束 8 、 9 。 近年来， 利用基因定位突变法改变 IL-2 中氨基酸的顺序， 观察突变体的活性 、 空间结构及与受体结合能力的变化， 获得许多 IL-2 结构与功能的相关信息 。 国内外许多学者进行了相关的研

10、究 。 就 IL-2 分子整体而言， 其天然构型的稳定性对其功能有非常重要的作用 。 IL-2 靠 58 位和 105 位的 Cys 间形成二硫键维持其空间结构 。 Wang 等 7 用特异位点诱变法修饰了 IL-2 基因上编码 Cys 的密码子，使之编码丝氨酸（ Ser ） 或丙氨酸（ Ala ），得到了 Ser 58 -IL-2 、 Ser 105 -IL-2 及 Ser 125 -IL-2 变异分子 。 这一突变导致了 IL-2 一级结构的微小改变， 一个氧原子代替了硫原子， 防止突变位点上形成二硫键 。 SDS-PAGE 分析证实，各种 IL-2 的分子量仍为 15KD ，但生物学活性

11、却有显著差别 。 Cys 58 和 Cys 105 被 Ser 替代后， IL-2 的活性几乎完全消失 10 ， 说明 58 位的 Cys 和 105 位 Cys 间的二硫键对维持 IL-2 的活性构像是必需的 。 Wang 等 7 发现 Ser 58 突变型 IL-2 活性低于 Ser 105 -IL-2 ， 这提示 58 位的 Cys 除参与二硫键外， 可能还有其它作用， 推测可能与结合 IL-2 受体有关 。 而当用 Ser （或 Ala ） 替代 Cys 125 时， IL-2 活性明显提高 10 ， 这说明 125 位的 Cys 不参与二硫键的形成，也不参与受体结合 。 对于基因工程

12、重组 IL-2 来说， 125 位的 Cys 的存在会引起分子内二硫键的错配，或分子间二聚体的形成，这虽不直接影响 IL-2 与受体的结合，但破坏了 IL-2 分子的天然构型，从而影响 IL-2 的活性，若将其改成 Ser 或 Ala ，就排除了 Cys 125 与 Cys 58 或 Cys 105 之间形成错配二硫键的可能性， 从而提高了 IL-2 的活性 。 Fukuhara 11 用质谱技术分析了 Turkat 细胞分泌的 IL-2 和基因工程产生的重组 IL-2 的氨基酸顺序也证实了上述结论 。 于忠国等 12 应用 PCR 和定点突变技术将编码 125 位的 Cys 的密码子突变成编

13、码丙氨酸（ Ala ） 的密码子， 将此突变基因受控于 P R P L 串连启动子和人工合成 SD 序列， 在 E.coli 中获得高效表达， 用凝胶过滤法分离表达产物获得新型白细胞介素 2 ， 其比活性达 1 10 7 IU/mg 蛋白 。 在 IL-2 空间结构中，不同的 螺旋区结构变化对其功能有不同影响 。 螺旋 A 的存在是 IL-2 活性所必需的 9 、 13 。 螺旋 B 区中当 30 49 位氨基酸缺失时， IL-2 活性急剧下降 13 、 14 。 螺旋 E 是 IL-2 与 IL-2 受体 亚基的结合部位， 而与 IL-2 的活性毫无关系 。 螺旋 A 、 B 、 F 均为两

14、亲性螺旋，其疏水面相互靠近成为一疏水核，是一重要的结构域， 可能与 IL-2 与 亚基的结合有关， 这三个 螺旋的稳定性及某些氨基酸如 17 Leu 、 20 Asp 、 42 Phe 、 44 Phe 、 45 Tyr 、 56 Leu 、 121 Trp 的侧链基团的极性和空间位置对活性有重要影响 10 。 4. IL-2 的基因结构与表达调控 自 1983 年 Taniquchi 15 等首次克隆了 IL-2 的 cDNA 后， 人们对 IL-2 的基因结构 、 表达调控进行了深入的研究 。 1984 年， Mita 、 Fujita 9 、 16 等从人类基因组文库中分离了人 IL-2

15、 的基因组基因，分析了人 IL-2 基因结构并确定其核苷酸序列和侧翼序列 。 IL-2 基因由 4 个外显子和 3 个内含子组成 。 外显子 1 含 5 端不翻译区并且编码 IL-2 起始的 49 个氨基酸， 其中前 20 个氨基酸为信号肽，在 IL-2 成熟时被水解掉 。 91bp 的间隔区（内含子） 后是编码 20 个氨基酸的外显子 2 ，随后是 2292bp 的长间隔顺序，其中含有与病毒增强子核心序列相似的核苷酸序列，有人认为这些序列对活化 T 细胞 IL-2 基因的表达可能有一定作用 。 外显子 3 编码接续的 48 个氨基酸，接下去的第三内含子长 1346bp 。 第 4 外显子编码余下的 36 个氨基酸 。 PolyA 信号在终止密码后的 261 个核苷酸处 。 小鼠 IL-2 基因基本组成与人类相似 9 、 17 、 18 ， 内含子区极少