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1、5 实验三. 显微镜的使用，细菌单染色及革兰氏染色 -10级生命基地 史倩 201005140081一 目的要求：1. 学习显微镜（特别是白色圈标记的油镜）的使用方法2. 学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术3. 初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征4. 了解革兰氏染色原理，并掌握其方法二 实验器材：1. 菌种大肠杆菌（Escherichia coli）,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），自制菌种2. 溶液和试剂革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，95%的乙醇
2、等。3. 仪器和其他用品酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯）,擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻片架子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。三 实验原理：1. 油镜的使用：在普通光学显微镜的通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大（性能与分辨率最高），对微生物的研究很重要！油镜头长度大于低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线或白线，并刻有100、1.25或oil等字样。其使用方法特殊需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这有两方面的原因：a. 增加照明度：油镜的透镜很小，光线通过玻片与油镜头之间的空气时，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显现不清。若在油镜与
3、载玻片之间加入和玻璃折射率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515），则使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。b. 增加显微镜的分辨率2. 值得指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。还需经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。平板划线分离法即为一种常用的分离纯化过程。 平板划线分离法的步骤：a. 倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，冷至5560时，在火焰旁，用左手持培养皿（皿盖打开一小缝），迅速倒入培养基约15mL。加盖后轻轻摇动，使培养基均匀分布在培养皿底部，后平置于桌面之上，待凝后即为平板。b. 划线: 再近火焰处，左手拿皿
4、底，右手拿接种环，挑取自选菌种在平板上划线（平行线之间距离小，使划线次数增加）。划线方法多样，其目的是通过划线将样品在平板上进行稀释，培养后形成但菌落。c. 及时灼烧接种环上剩余的菌体3. 涂片法：对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹使细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定，使其细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上。这种加热处理可以杀死大部分细菌而且不破坏细胞形态。4. 简单染色：利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。用于染色的物质为一类苯环上连着发色基团或助色基团的有机化合物。发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使其形成盐。只有发色基团而无助色
5、基团的苯化合物（色原）即使有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，难以与细胞结合而染色。常用的微生物染料都是盐，分碱性染料（美蓝-亚甲蓝，结晶紫，碱性复红，沙黄-番红，孔雀绿)和酸性染料（酸性复红，伊红，刚果红）。通常采用碱性染料进行简单染色，因为微生物细胞在碱性，中性及弱酸性的环境中多带有负电荷，而染料电离后染色部分带正电性，易相互结合。当细胞处于酸性条件时（如分解糖类产酸）所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。5. 革兰氏染色法：可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。首先是制片，取活跃期的菌种按常规的涂片
6、方法涂片干燥，固定。再利用草酸铵结晶紫初染，染色12分钟，水冲洗至水无色，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理（冲去水迹，再用碘液覆盖1分钟），由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂精心处理时，两种细菌的脱色效果不同。用水冲洗至无色，再用番红染色2分钟，干燥后镜检。革兰氏阳性细菌(如Staphylococcus aureus)细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持
7、原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌（如 Escherichia coli）细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，避薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红色）。四 实验内容：1. 显微镜的构造与使用：a. 取放-双手托着显微的镜壁与镜座b. 对光-调节光圈，转换器及平凹面镜，双目镜要调节目间距至一个圈c. 低倍镜观察高倍镜观察d. 油镜的使用： 将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。 转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时
8、，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。 用双眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止 油镜使用完毕，先用擦镜纸擦一遍,再用沾少许二甲苯的擦镜纸将镜头上和标本上的香柏油擦去，最后再用干擦镜纸擦干净2. 单染色：a. 涂片：取一块载玻片，用记号笔平均分为两个区域并标记；各滴一小滴生理盐水于两个区域中央；用接种环无菌操作分别由枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面和金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面挑取适量菌苔，在生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。若用液体培养物涂片，可用接种环沾取12环直接涂于载玻片上。b. 干燥：可自然干燥或酒精火焰上灼烧干燥c. 固定：涂菌面朝上，
9、通过火焰23次d. 染色：滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位1mine. 水洗：倾去染液，自来水冲洗载玻片另一面f. 干燥：用吸水纸吸去多余水分，自然干燥或用电吹风g. 镜检：将制备好的样片在显微镜下观察记录3. 革兰氏染色：1 制片取片擦净，并烘干取活跃生长期菌种按常规方法（酒精灯旁边接种细菌）涂片（不宜过厚）、干燥和固定。2. 初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1-2min后倾去染液，水洗至流出水无色。3 媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。4 脱色将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管覆盖95%乙醇脱色30s，然后立即用水洗去乙醇。5
10、 复染将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水晾干。6 镜检油镜观察。4. 菌种的接种用接种环在空白试管斜面上接种大肠杆菌，金葡，枯草杆菌各三支，做好标记。包好后放在37环境下培养，供给周四组做实验。五 结果与分析1. 结果记录菌种染色结果绘图大肠杆菌红色，细杆状，革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌蓝紫色，球状聚集，革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌蓝紫色，长杆状，革兰氏阳性菌自选菌红色，长杆状，革兰氏阴性菌 大肠杆菌（单染色） 枯草芽孢杆菌（单染色） 金黄色葡萄球菌（单染色）六 思考与讨论：1 本实验中应注意些什么？答： 显微镜使用时：a. 无论是单筒或双筒的显微镜均应双眼同时睁开
11、观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图记录b. 显微镜具有聚焦校正功能，因此观察时一般可摘下眼镜。若需配戴眼睛观察应注意不要使眼镜片与目镜镜头相接触，以免造成划伤。细胞涂片时应注意哪些环节：a. 用记号笔做好标记b. 菌种不可接种太多，稍减滴液浑浊即可。革兰氏染色时避免造成假阴性的措施：a. 选用活跃活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性b. 涂片不宜过厚，以免形成假阳性c. 脱色是革兰氏染色的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过多造成假阴性实验结束后：要记住洗净双手，因为金黄色葡萄球菌为条件致病菌，二甲苯为有毒物质。2. 进行细菌制片时为什么要进行加热固定？这要注意什
12、么？答：加热固定细菌其实是一个杀死细菌的过程，将平铺在载玻片上的细菌通过酒精灯加热，死细菌就会被固定，这便于我们在显微镜下染色观察。同时，在加热的时候温度要掌握好，如果温度过高就会使细菌变形，影响我们的观察判断。3. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？答：用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察.正常情况下,观察前要用擦镜纸擦拭干净.另外,一般作细菌装片不用盖盖玻片,所以待干燥后才能观察.如果盖上盖玻片后就不用考虑需要干燥的问题.5.你是否观察到金黄色葡萄球菌细胞聚集成葡萄串状？试解释其形成原因答: 细胞壁粘连性比较强,分裂后不分散.而且分裂轴向基本不变,只往一个方向分裂
