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1、第 0 页 共 19 页编号：888888 菌液稀释级数确认方案888888888有限公司8888年88月目 录1 目的2 适用范围3 依据4 验证时间5 验证小组成员及职责6 验证所需要仪器设备、培养基、菌种及关键操作文件7 接受标准8 测试方法9 测试结果10 异常情况及处理11 结论12 再验证周期 1 目的建立菌液稀释级数确认方案，确定含菌量为50100cfu/ml或10100cfu/ml时，各试验菌应当稀释的倍数或级数。2 适用范围2.1 本确认方案适用于验证试验或日常工作中涉及的菌种稀释操作。2.2 确认对象为：50100cfu/ml：大肠埃希菌MCC(B)44102、金黄色葡萄球
2、菌CMCC(B)26003、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、白色念珠菌霉CMCC(F)98001。10100cfu/ml：乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094。3 依据药品GMP现行版、药品GMP指南国家药监局认证中心编写 2011年版中国药典现行版。中国药品检验标准操作规程现行版。4 验证时间 验证方案于 2014 年 月 日批准后，整个验证活动应在10个工作日内完成。5 验证小组成员及职责小组职务岗位姓名责任组长化验室主任主任编制验证方案，编制验证报告；进行验证过程及结论的评价与分析；组织协调实施本验证工作。组员QA主管对编制的方案进行审核质量部部长批准再验证方案；评价与分析确认
3、结果；对验证报告进行最终结论。QA监督和复核方案实施过程。微检QC负责方案的执行。6 验证所需要的仪器设备、培养基、菌种及关键操作文件6.1 验证需用仪器设备器具名称规格型号检定日期检定单位有效期细菌培养箱霉菌培养箱高压蒸汽灭菌器架盘天平水浴锅净化工作台（阳性）6.2 试验培养基名称生产厂家批号有效期营养琼脂培养基营养肉汤培养基玫瑰红钠琼脂培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基6.3 试验菌种菌珠名称来源购入日期传代次数大肠埃希菌MCC(B)44102金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501白色念珠菌霉CMCC(F)98001乙型副伤寒沙门菌
4、CMCC(B)500946.4 验证所需要关键文件及存放地方关键资料名称存放地点细菌培养箱使用和清洁操作规程霉菌培养箱使用和清洁操作规程高压蒸汽灭菌器使用和清洁操作规程舒筋活血丸质量标准及检验方法微生物限度检查法操作规程7 接受标准7.1 阴性对照组测试结果应为阴性。7.2 各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。7.3 各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级的菌落数应呈约10倍关系。8 测试方法 按药典方法制备菌液，取1ml菌液在若干支含9ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，逐级稀释成100、10-1、10-2、10-8级数的菌悬液。分别取各级1ml，
5、注入平皿，倾倒在琼脂培养，按平皿计数法培养，测定各级菌落数。该试验独立平行进行3次。8.1 菌液制备8.1.1 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物分别接种至3支10ml营养肉汤培养基中，经32.52.5培养1824h，备用。8.1.2 取色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，经25.52.5培养2448h，备用。8.2 无菌氯化钠溶液的制备至少准备9ml/支9支0.9%的无菌氯化钠溶液。8.3 稀释8.3.1 分别取1ml菌液（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌）在1支含9ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，用吸管
6、吹打约10下，即成10-1级，吸取该管菌液1ml至下支含9ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，用刻度管吹打约10下，即成10-2级，依次，逐级稀释直至10-8级数，每递增一个稀释级，必须换一个吸管。8.4 注皿 分别吸取上述各菌各级菌悬液1ml于平皿中，平行制备2个皿，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌倾倒约15ml的营养琼脂培养基，白色念珠菌倾倒玫瑰红钠琼脂培养基。按微生物限度检查法操作规程中的平皿法，培养，测定各皿各菌菌落数。9 测试结果：见附表1、2、3。10 异常情况及处理： 质量负责人： 验证小组组长： QA：11 结论11.1 按照本确认方案，确定了各菌达到规定
7、含菌量时的稀释级别。菌珠名称含菌量确定的稀释级别大肠埃希菌MCC(B)4410250100cfu/ml金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501白色念珠菌霉CMCC(F)98001乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)5009410100cfu/ml 质量负责人： 验证小组组长： QA：12 再验证周期12.1 当操作人员或接种方法发生变化时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。12.2 国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。12.3 定期验证暂定为二年。附表1 菌液稀释级别确认记录（单位：cfu）第1次试验试验日期：报告日期： 培养皿性质营养琼
8、脂培养基玫瑰红钠培养基金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌乙型副伤寒沙门菌白色念珠菌培养温度培养时间级数皿号12平均12平均12平均12平均12平均10-010-110-210-310-410-510-610-710-8接受标准50100cfu/ml10100cfu/ml50100cfu/ml符合要求的级数分析：1、阴性对照组，即10-0级，测试结果应为阴性。 结果：符合要求 不符合要求 2、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：符合要求 不符合要求 3、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级的菌落数应呈约10倍关系。 结果：符合要求 不符
9、合要求 检验人：复核人：质量部QA:附表2 菌液稀释级别确认记录（单位：cfu）第2次试验试验日期：报告日期： 培养皿性质营养琼脂培养基玫瑰红钠培养基金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌乙型副伤寒沙门菌白色念珠菌培养温度培养时间级数皿号12平均12平均12平均12平均12平均10-010-110-210-310-410-510-610-710-8接受标准50100cfu/ml10100cfu/ml50100cfu/ml符合要求的级数分析：1、阴性对照组，即10-0级，测试结果应为阴性。 结果：符合要求 不符合要求 2、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：符合要求 不符合要求 3、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级的菌落数应呈约10倍关系。 结果：符合要求 不符合要求 检验人：复核人：质量部QA:附表3 菌液稀释级别确认记录（单位：cfu）第3次试验试验日期：报告日期： 培养皿性质营养琼脂培养基玫瑰红钠培养基金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌乙型副伤寒沙门菌白色念珠菌培养温度培养时间级数皿号12平均12平均12平均12平均12平均10-010-110-210-310-410-510-610-7
